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ELISA实验技术点

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上传时间：2014/10/10 10:09:47

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上传者：杰辉生物（北京）科技发展有限公司

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ELISA实验技术点

为了得到更好的实验结果，一些ELISA实验新手们还需多加了解技术内容，北京杰辉博高生物公司每周都会为您精心整理出重点技术要领，能够熟练的掌握好这些之后再应用到实验里面就会简单的多。下面来看看今天的重点内容：ELISA实验技术点。

样本加样方法
1、细胞上清：前处理必须是细胞离心去除，每孔直接加100μl即可。如果浓度太高需稀释时，用标准品稀释液直接稀释。
2、脑脊液：前处理必须是细胞离心去除，每孔直接加100μl即可。如果浓度太高需稀释时，用标准品稀释液直接稀释。
3、血清血浆：请加入50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本,如稀释量大，请将样本与样本分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100ul。
A.血清标本应是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；
B.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集若待测样本不能及时检测，标本收集后请分装，冻存于－20℃，避免反复冻融。
C.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；
D.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。
E.请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确。
4、组织匀浆液的样本，要制备过程中需要在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，防止蛋白成份被内源性蛋白酶降解，造成检测结果的值偏低。
因组织匀浆液的样本蛋白种类多，含量丰富，实验参照血清血浆标本的处理方法进行，否则就会影响实验结果。具体是加入50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本，需稀释时，请将样本与样本分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100ul。
因为目标蛋白不同，可能造成降解的蛋白类型可能不一样，如果实验前通过文献确定用哪种蛋白酶抑制剂，有针对性加入，可节省抑制剂。如果查不到相关文献，可采用组合抑制的办法确保蛋白不易被降解。

检测范围及灵敏度相关问题
1、不同厂家的试剂盒的检测范围并不相同，一般说来，诊断试剂的检测范围以ng/ml计。而常见的科研试剂盒中的样本中的目标蛋白，范围可随样本的类型而变化。所以实验前应通过文献和预实验的方法确定样本是否在所购试剂盒的范围内，如果不在检测范围内，分两种情况对待。
A.如果样本中目标蛋白太低，需找相应灵敏度更高的试剂盒来检测或浓缩样本；
B.如果样本中目标蛋白太高，则需要进一步稀释后进行检测
2、灵敏度的问题
一般说来，如果待测样本中目标蛋白的浓度比较高，则对灵敏度要求相对小一些。如果待测样本中目标蛋白的浓度比较低，则必须考虑灵敏度的问题。一般来说，试剂盒曲线上的最小浓度是比较准确的，低于这个值因为与曲线是个“S”型结构有关，所以结果是有偏差的，是一种估算。再加上实验误差，所以达不到理想的效果。建议选择试剂盒时，应该看曲线上最小的浓度值，而不是试剂盒上写的灵敏度。