艰难梭菌毒素A+B抗原检测试剂（粪便样本）

（德国DRG：EIA-4448）

应用范围

此酶联免疫试剂盒仅用于体外检测，定性检测粪便和细胞上清液中的艰难梭菌毒素A+B抗原。

简介

艰难梭菌是人类肠道内的正常菌群，如果过度服用抗生素，艰难梭菌就会变成致病菌。Hall和 O’Toole在1935年将此菌分类到了可产生毒素的菌群中。艰难梭菌的毒素株会产生两类毒素：毒素A，肠毒素；毒素B，细胞毒素。直到1970后期，人们发现了艰难梭菌与伪膜性肠炎有所关联时才确定艰难梭菌是致病菌。伪膜性肠炎是一类与抗生素相关联的疾病，主要发生腹泻和急性粘膜坏死性炎症，从而形成由纤维蛋白、粘液层、坏死上皮细胞和白血球构成的克隆伪膜性肠炎。

尽管在50%多的无症状克隆婴儿患者的粪便中发现了艰难梭菌毒素，而且还有高浓度的毒素A和毒素B，但是只有少数会最终患有PMC（伪膜性肠炎），剩余的都是无症状的。对于这种现象可能的原因包括：母乳能够中和毒素A和毒素B，胎儿肠细胞对毒素A的敏感度降低，或者是缺乏毒素受体。少数病例显示，囊性纤维变性患者对PMC（伪膜性肠炎）敏感度降低。诊断抗生素与结肠炎相关的最普遍的临床方法是细胞培养和乳胶凝集试验。细胞培养试验可以发现毒素B对细胞的一个影响作用，这个试验的敏感度很高（50pg/ml毒素B），但是最少也要2天才可以完成。乳胶凝集是一种可以通过粪便来筛查出与艰难梭菌相关联的蛋白质的方法，即使交叉反应和不会产生毒素的艰难梭菌也会被检测出来。

很多研究者已表明酶联免疫法可以检测出1-10ng/ml的毒素A或是毒素B。

ELISA试剂盒检测原理

检测粪便中的艰难梭菌毒素A+B抗原利用的是夹心法。

粪便或者细胞上清液中的艰难梭菌和阳性质控与包被孔中的单克隆抗毒素A和B抗体反应，温育后，未连接的成分被洗涤除去。

然后在第二次温育中连接到包被孔的毒素会特异性地与生物素化的多克隆抗毒素A和B抗体反应，未连接的材料会被洗涤除去。

在下一步的温育中，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素会与生物素化的抗体反应，经洗涤步骤除去未连接酶联物。

然后加入底物显色液TMB，显蓝色，加入终止液终止反应，溶液由蓝色变成了黄色。在酶标仪上读取吸光度，吸光度直接与艰难梭菌毒素A和B的量成正比例。

经与临界值比较，可以判定结果为阳性或者阴性。

样本的制备和保存

1、检测粪便样本：

粪便样本收集后立即保存在2-8℃，并在72小时内进行实验。

可保存在-20℃，并应避免反复冻融。

如有需要可以保存在-80℃。

用福尔马林保存的样本，不能在该实验中使用。

若粪便样本已经使用样本稀释液进行稀释的，可保存在2-8℃过夜，然后在第二天进行实验。

制备：

使样本平衡至室温，并混匀。

移取1000ul的样本稀释液至一支干净试管中。

使用一根一次性的取样棒，如果是固体，则移取200mg的粪便样本，如果是液体就取200ul，然后加入到上述试管中并完全悬浮。

如果需要可以在微型离心机上最大速度旋转1分钟。

2、检测细胞上清液：

将艰难梭菌放置血液或者选择性琼脂上（例如CCFA）培养，在缺氧环境下，培养48小时，则可直接进行该ELISA实验。

移取1000ul的样本稀释液至一支干净试管中。

使用接种环2-4次，转移艰难梭菌培养液至样本稀释液中，并在混合器中全部悬浮。ELISA实验使用该溶液100ul。

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