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恒远文献:Ghrelin 抗体在文献中的应用
点击次数： 568发布时间：2020/3/27 11:38:58
- 上 传 者： 上海恒远生物科技有限公司
- 上传时间： 2020/3/27 11:38:58
- 文件大小： 634KB
- 文件类型： pdf
- 所属分类： 应用方法
- 下载次数： 100次
- 查看次数： 568
资料简介：
李 杨1，2， 王 峰1，3， 刘 诤1，3， 杨光明1， 张 震1， 杨 武1， 孙 涛1，3
( 1． 宁夏医科大学颅脑疾病重点实验室，银川 750004; 2． 宁夏医科大学第二附属医院神经外科，
银川 750001; 3． 宁夏医科大学总医院神经外科，银川 750004)
方法 健康雄性 SD 大鼠 64 只，随机分为空白组( n = 8) 、假手术组( n = 8) 和点燃组( n = 48) ，点燃组以最后一次刺激为零点，再分为 3、6、12、24、48 和 72h 六个亚组，每个亚组 8 只。空白组不予处理; 假手术组只植入电极不予刺激; 点燃组植入电极后给予电刺激，制作杏仁核点燃致痫膜型。采用 ELISA 法检测血清中辛酰基化 Ghrelin 的浓度，并应用免疫组化和实时荧光定量 PCＲ 技术分析下丘脑中辛酰基化 Ghrelin 与 Ghrelin mＲ-NA 的表达情况。结果 假手术组与空白组比较，表达水平差异无统计学意义( P ＞ 0． 05) ; 与假手术组比较，点燃组大鼠血清中辛酰基化 Ghrelin 与下丘脑中辛酰基化 Ghrelin 与 Ghrelin mＲNA 的表达水平均显著降低( P ＜ 0． 05) ，并且二者在各时间点的变化趋势基本一致，即在癫痫发作后 3h 外周血中辛酰基化 Ghrelin 的浓度与下丘脑中辛酰基化 Ghrelin 及 GhrelinmＲNA 表达均降低，6h 继续降低，在 12h 反弹出现一个峰值，而后在24、48、72h 逐步降低。结论 癫痫发作后，血清与下丘脑中神经肽 Ghrelin 水平均降低且变化趋势是一致的，通过检测血清中辛酰基化 Ghrelin 水平，可以反映下丘脑中相应神经肽的变化趋势，可能成为临床癫痫诊断和疗效评估的一种新型检测指标。
关键词: 杏仁核; 点燃; 癫痫; 神经肽
中图分类号: Ｒ338． 2 文献标识码: A
Ghrelin 是一种由 28 个氨基酸组成的具有多种生理功能的胃动素相关的神经肽。目前研究证实，它与癫痫发作有关。本研究通过杏仁核电点燃法建立大鼠癫痫模型，应用 ELISA、免疫组化以及实时荧光定量 PCＲ 技术，检测大鼠血清辛酰基化 Ghrelin 和下丘脑中 Ghrelin 的表达水平，并观察二者在大鼠癫痫发作后各个时间点的表达情况，初步探讨其变化的原因及意义。
1 材料与方法
1． 1 主要试剂 5g·L － 1戊巴比妥钠( 美国 Sigma 公司) ; ELISA 试剂盒及辛酰化 Ghrelin 抗体( 上海恒远生物有限公司) ; 兔超敏二步法免疫组织化学检测试剂盒 PV － 9001 与 DAB 显色试剂盒ZLI9017( 北京中杉金桥生物技术有限公司) ; 实时荧光定量 PCＲ 反应试剂盒#K1621 逆转录系统与即用型 2X 预混母液( 美国 Thermo 公司) ; 引物合成( 上海生工生物工程技术服务有限公司) 。
1． 2 实验动物及分组 清洁级 6 ～ 8 周龄雄性Sprague － Dawley 大鼠由宁夏医科大学实验动物中心提供，体重 250 ～ 280g，单笼饲养。温度保持在 20 ～ 23℃，湿度 8% ～ 10% ，自由饮食，昼夜节律。按照随机数字表法分为空白组( n = 8) 、假手术组( n = 8) 、点燃组( n = 48) ，点燃组以最后一次刺激结束开始计算，分为 3、6、12、24、48 和 72h 六个亚组( n = 8) ［1］。空白组不作处理，假手术组只植入电极不予刺激; 点燃组植入电极并给予电刺激，制作杏仁核点燃癫痫模型。
1． 3 模型构建［1］ 戊巴比妥钠腹腔注射，SＲ －5Ｒ 脑立体定向仪固定头部，暴露颅骨，根据大鼠脑立体定位图谱确定左侧杏仁核位置( 前囟后2. 8mm、左旁开 4． 9mm、硬膜下 8． 6mm) ，植入双极电极，做刺激电极，于右额( 前囟前 1． 5mm、右旁开 1． 5mm、硬膜下 0． 5mm) 植入单极电极，做皮层记录电极，牙托粉将电极固定于颅骨表面，术后预防 感 染。术 后 恢 复 2 周，采 用 A － MSYS�TEMS2100 刺激器刺激大 鼠，测定大鼠后放阈。
测完后第 2 天开始，每天按后放阈强度 1． 5 倍刺激 2 次，刺激间隔时间 ＞ 60min。向方波，波宽 1． 0ms，频率 60Hz，持续 1s，观察癫痫发作强度，按 Ｒacine 分级评分，连续 5d 引出 V级( 后肢站立并跌倒，全身抽动，湿狗样抖动，发作时间约 15s 到数分钟) 发作定义为点燃成功。
1． 4 标本采集与切片 不同时间点麻醉大鼠，应用负压采血管采集鼠尾血 2mL，室温静置 15min，3500r·min － 1离心 10min，取上层血清放置 － 20°C保存，用于后续实验; 取血之后，每组中 2 只大鼠用 0． 9% 生理盐水及 4% 多聚甲醛经左心室灌注后固定取脑，4% 多聚甲醛后固定，酒精梯度脱水，常规石蜡包埋，自视交叉处连续冠状切片，片厚5μm，用于后续免疫组织化学实验; 6 只断头取脑，取下丘脑，液氮中冷冻，然后转移至 － 80℃ 冰箱保存，用于后续实时荧光定量 PCＲ 反应。
1． 5 辛酰基化 Ghrelin 的浓度测定 严格依照ElISA 试剂盒提供的说明书要求，检测各组大鼠血清中辛酰基化 Ghrelin 的浓度。整个操作过程在无 ＲNA 酶的环境中进行，使用无酶枪头及无酶EP 管。
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