EHA101感受态（电转）

产品简介 EHA101 菌株为C58型背景，核基因中含有筛选标签 ——利福平抗性基因Rif，为了便于转化操作， 此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型 Ti 质粒 pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)，此质粒含有 vir 基 因 (vir 基因是 T-DNA 插入植物基因组必需的元件， pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)质粒自身的 T DNA 转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体 T-DNA 顺利转移)。pEHA101 (pTiBo542DT DNA) 型 Ti 质粒含有筛选标签： Kan，赋予 EHA101 菌株卡那霉素抗性，适用于玉米、水稻、烟草 等植物的转基因操作。 本公司 开发的 EHA101 电转感受态特别适用于大质粒的转化：经 pK7WGF2 质粒 (壮观霉素抗性， size:11876 bp)检测转化效率>105cfu/µg DNA。 产品组成 组分 EHA101 电转感受态细胞 10 × 50µL 100 × 50µL 定制 基因型：C58 (RifR ) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (KanR ) Nopaline 存储条件 -80 ℃ 保存；请勿将本品置于-20 ℃或者液氮中保存。 质量控制 除胭脂碱型 Ti 质粒 pEHA101 外，无外源质粒 DNA 残留； 电转法转化效率 ≥105cfu/µg DNA。 使用方法 1. 将新的 2 mm 电击杯插入冰中预冷；或者将储存于 75%乙醇中的 2 mm 电击杯和杯盖取出，在超净工 作台中将其倒 置于干净的吸水纸上，使乙醇充分挥发， 然后插入冰中预冷； 2. 取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中待其融化，加入 0.01-1 µg质粒 DNA（体积不大于 5 µl），用 200 µl 枪头将感受态-质粒混合物快速转移到预冷的电击杯中，盖上杯盖； 3. 开启电转仪，设置参数（2500 V ，200 Ω，25 µF），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成后快速插 入冰中，加入 900 µl 无抗生素的 YEB 并将感受态细胞转移到无菌空管中，28 ℃振荡培养 2~3 小时。 （注：此电转化参数为 Bio-rad 推荐，使用者也可使用电转仪所推荐的 Protocol 进行操作） 4. 6000 rpm 离心一分钟收菌，留取 100 µl 左右上清将菌体轻轻吹匀，并涂布于含相应抗生素的 YEB 平 板上，倒置放于 28℃培养箱培养 2~3 天（当平板只含有转化所用双元载体抗生素时，28℃培养 48 小时 即可；平板中同时加入双元载体抗生素，20µg/ml Rif 时，需 28℃培养 60h；如果使用的平板含有 50 µg/ml rif 则需要 28℃培养 72-90 小时）。 注意事项 1. 感受态细胞解冻后应立即使用； 2. 加入的待转化 DNA 的总体积不应超过感受态细胞体积的 1/10； 3. 利福平浓度不应高于 25 µg /µl，利福平浓度过高不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。 4. 由于 Ti 质粒丢失的概率极低（可以忽略），所以相关抗性基因可以不用添加。