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NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)测试盒2022生物已更新
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详细内容
紫外分光光度法
正式测定务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
MDH (EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,线粒体中 MDH 是 TCA循环的关键酶,催化苹果酸形成草酰乙酸;相反,胞浆中 MDH 催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物, 连接多条重要的代谢途径。因此,MDH 在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色,包括线粒体的能量代谢、 苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性,MDH 分为 NAD-依赖的 MDH 和 NADP-依赖MDH, NADP-MDH 主要存在于真核细胞中。
测定原理:
NADP-MDH 催化 NADPH 还原草酰乙酸生成苹果酸,导致 340nm 处光吸收下降。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1 mL 石英比色皿和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
试剂一、提取液 60 mL×1 瓶,在 4℃保存;
试剂二、液体 50 mL×1 瓶,在 4℃保存;
试剂三、粉剂×2 支,-20℃保存;临用加入 300μL 蒸馏水,现配现用;
试剂四、粉剂×2 支,-20℃保存;临用加入 300μL 蒸馏水,现配现用。
样本测定的准备:
1、细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,
加入 1mL 试剂一),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。
测定步骤:
1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2、 将试剂二在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min 以上。
3、 操作表:
| 试剂名称(μL) | 测定孔 |
| 样本 | 20 |
| 试剂二 | 760 |
| 试剂三 | 10 |
| 试剂四 | 10 |
将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中,混匀后立即在 340 nm 波长下记录初始吸光度A1 和反应 1min 后的吸光度 A2,计算 ΔA=A1-A2。
注意:若 A1-A2 大于 0.5,需将样本用提取液稀释,使 A1-A2 小于 0.5,可提高检测灵敏度。
计算公式中乘以相应稀释倍数。

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