人皮肤成纤维细胞的培养方法及应用

　　（1）英文名称：HSF

　　（2）中文名称：人皮肤成纤维细胞

　　（3）取材自引产的15周胚胎组织，中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心建立。在本库通过STR鉴定，未发现交叉污染现象。

　　（4）规格：T25方瓶或1ml冻存管

　　（5）智立编码：20211259102007202

　　（6）组织来源：人皮肤

　　（7）生长方式：贴壁生长

　　（8）细胞形态：成纤维样

　　（9）培养液：H-DMEM+15%FBS+1%P/S

　　（10）培养条件：37℃，5%CO2

　　（11）运输方式：常温运输（T25方瓶）或干冰运输（冻存管）

　　二、贴壁细胞传代方法：

　　1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

　　2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3ml此细胞的培养基终止消化。

　　3、轻轻吹打后吸出，移入15ml离心管中，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养液后吹匀。

　　4、移入到事先准备好的含有5ml培养基的培养瓶中或含有14ml培养基的培养瓶中培养。

　　三、 人皮肤成纤维细胞的培养方法及应用

　　用于绞股蓝总皂苷对人皮肤成纤维细胞光老化模型凋亡信号通路的影响研究：

　　通过采用长波紫外线（UVA）辐射人体皮肤成纤维细胞（HSF），诱导细胞发生光老化现象后，采用不同浓度绞股蓝总皂苷（Gyp）含药血清进行干预，观察各组皮肤细胞在增殖活性、ROS含量、细胞凋亡数量以及凋亡相关调控因子Bcl-2，Bax，Caspase-3mRNA和蛋白表达变化，探究Gyp干预光老化细胞凋亡作用相关分子机制，探索Gyp对HSF细胞光老化损伤有明确防治作用新靶点，为绞股蓝作为靶点药物用于防治人体皮肤光老化及相关疾病提供理论基础及实验数据。

　　实验材料：健康SPFSprague-Dawley（SD）雄性大鼠20只，体重200～250g。皮肤成纤维细胞株（HSF）；绞股蓝总皂苷（MUST-11031401）；DMEM高糖培养液；胎牛血清（FBS）；胰蛋白酶；PBS缓冲液；二甲基亚砜（DMSO）；UVA光源（20W），紫外光光度计；MTT；细胞凋亡原位检测试剂盒；水合氯醛；青/链霉素；无水乙醇；75%乙醇；兔抗人Bax、Bcl-2及内参β-actin抗体；HRP标记的羊抗兔二抗；ECL发光试剂盒；Trizol；Bax、Bcl-2及内参引物；PCR仪、电泳仪，凝胶成像分析系统；细胞蛋白提取试剂；BCA法蛋白定量试剂盒；ECL发光液；电热恒温振荡器；酶标仪；凝胶成像分析系统；水平摇床；垂直板电泳装置；电泳仪；转印电泳槽等。

　　Gyp对光老化皮肤成纤维细胞增殖的影响：

　　1、绞股蓝总皂苷（Gyp）含药血清制备将20只SD大鼠按随机数字法分为空白血清对照组和Gyp含药血清组。含药血清组给予Gyp粉末生理盐水溶液（生药质量浓度为80mgKg-1d-1）灌胃，空白血清对照组给予等体积的生理盐水，连续灌胃7d。然后于腹主动脉采血，血液经离心后分离出血清，冻存备用。

　　2、人皮肤成纤维细胞（HSF）培养及光老化模型复制将HSF细胞株消化传代。待倒置显微镜下观察到细胞长满瓶底时，放入冰箱中保存。造模时，取出冻存的HSF细胞，解冻后将细胞悬液移入培养瓶，加入新鲜培养液培养。

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