人支气管上皮细胞的培养步骤

　　细胞名称：人支气管上皮细胞

　　

　　规格：T25培养瓶

　　种属：人

　　组织：肺、气管、支气管

　　细胞信息：16HBE/（STR鉴定正确）

　　细胞特性

　　1）来源：人支气管

　　2）形态：上皮细胞样贴壁生长

　　3）含量：>1x106细胞数

　　运输和保存

　　干冰运输及复苏好存活细胞

　　（1）1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。

　　（2）T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。

　　细胞培养步骤

　　1、培养基及培养冻存条件准备：

　　1）准备：准备角质细胞无血清培养基或者KM(SCIENCELLCATNO:2101)，添加对应因子，1%P/S来培养细胞。

　　2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

　　3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配，液氮储存。

　　2、细胞处理：

　　1）冻存细胞的复苏：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

　　2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

　　3）细胞冻存：收到细胞后建议在培养3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

　　对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

　　1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

　　2、加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

　　3、轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

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