Chapter 01

单细胞蛋白质组学（single-cell proteomics, SCP）一直面对一个最基本的物理限制：一个细胞里究竟有多少蛋白质可供检测？对于较大的 HeLa 等上皮来源细胞，单细胞总蛋白量通常处于数百 pg 量级；而许多外周血免疫细胞直径只有约 6–8 μm，蛋白质总量显著更低。因此，单细胞蛋白质组学真正困难的并不只是“分析一个细胞”，而是在低上样量同时控制样品损失、维持色谱分离，并获得足够高的质谱灵敏度和数据完整性。2026 年9月发表于 Nature Communications 的研究 Extending single-cell proteomics from HeLa to small primary human immune cells，针对这一问题系统优化了低上样量处理、液相色谱、FAIMS 和质谱采集方法，并进一步使用 Orbitrap Astral Zoom 开展超上样量分析和单细胞分析。

在单个 HeLa 细胞中可常规实现最高约 7000 种蛋白的定量，并达到超过 100 SPD的分析通量；进一步应用于原代人外周血单个核细胞（PBMC）时，可在单细胞层面鉴定最高约 4000 种蛋白。

这项研究值得关注的地方，是它对低上样量 LC-MS 条件进行了系统优化，包括如更窄内径色谱柱、减少表面吸附损失的 DDM、窄窗口 DIA 采集范围以及色谱流速和梯度优化。在 250 pg HeLa digest 等低上样量的实验中，作者发现，将 DIA-MS/MS 的采集范围集中到更具蛋白质组信息量的 m/z 区间，可以把有限的离子注入和扫描资源更多地用于真正能够贡献蛋白鉴定的信息区域。研究随后进一步结合 Orbitrap Astral Zoom 的 Low Input Mode 和 FAIMS，提高超低上样量条件下的灵敏度。所以，单细胞性能提升来自一个完整系统：包括样品处理损失降低、色谱优化、采集方法、FAIMS、质谱灵敏度和数据分析。

Fig.1 单细胞蛋白质组工作流程示意。单个 HeLa 细胞经 CellenOne 分选和消化后，通过 LC、FAIMS 和 Orbitrap Astral Zoom 进行分析。

（点击查看大图）

在优化后的工作流中，研究人员进一步采用 FAIMS、Orbitrap Astral Zoom 和较长梯度进行单个 HeLa 细胞深度分析。在不同数据分析策略下，单细胞蛋白质组的中位蛋白鉴定数达到 6688、7108、7301 等水平。

Fig.2 单个HeLa细胞中可达到超过7000个PGs的鉴定深度（点击查看大图）

“7000+”当然不会是我们的目标终点。在通量方面，在直接进样模式下，250 pg HeLa digest 即使提高至 150 SPD，仍可鉴定约 6200 种蛋白；trap-and-elute 模式进一步达到 240 SPD 时，仍获得约 5300 种蛋白。单个 HeLa 细胞实验中，直接进样在 60 SPD 条件下中位数约 7000 种蛋白，在 100 和 115 SPD 时仍分别约为 6800 和 6500 种。 所以，单细胞蛋白质组学正在从“能否测到”进入“能否以足够大的样本规模稳定测量”的阶段。这对于研究细胞异质性，可能更加重要。

从 HeLa 到 PBMC：细胞大小仍然决定分析边界

如果只看“7000 蛋白”，很容易产生一个误解：是不是所有单细胞都已经可以达到类似深度？

答案是否定的。那么，当我们去比较 HeLa、HEK293T 和 PBMC 的细胞尺寸：HeLa 和 HEK293T 通常处于约 20–30 μm，而混合 PBMC 群体大量细胞只有 6–16 μm；最小的 6–8 μm 细胞，其单细胞蛋白量可比大细胞低约 50 倍。 因此，PBMC 实验实际上提供了一个比 HeLa 更严格的灵敏度测试。对于经过筛选的最小 PBMC，研究获得约 900–1800 proteins/cell；FAIMS 可进一步提高鉴定数量。对于更完整的混合 PBMC 群体，在 Orbitrap Astral Zoom + FAIMS 条件下，不同的软件分析分别获得约 3400 和 4200 proteins/cell。

所以，在优化的工作流中，大型 HeLa 单细胞的蛋白质组覆盖已经突破 7000 种；对于蛋白质含量显著更低的原代 PBMC，也已经可以获得数千种蛋白的单细胞覆盖。

由于临床和转化研究真正关心的，往往不是培养皿中体积较大的模型细胞，而是来自真实样本的 T 细胞、B 细胞、NK 细胞、单核细胞等原代细胞。文章数据进一步显示，这样的蛋白质组深度已经能够识别区分单核细胞、T 细胞以及活化淋巴细胞的关键标志物。单细胞蛋白质组由此开始从“技术展示”进一步走向直接解析临床相关原代细胞异质性。

Fig.3 不同细胞类型的尺寸分布及最小PBMC的单细胞蛋白质组检测表现（点击查看大图）

Chapter 02

单细胞关注的是极低样品量，药物发现面对的则是另一个问题：

如果有数百甚至数千个化合物和处理条件需要比较，深度蛋白质组能不能真正跟上筛选规模？传统 LC-MS 蛋白质组分析中，一个样本占用数十分钟甚至数小时并不罕见。对于大规模化合物筛选而言，仪器时间因此很容易成为瓶颈。2026 年 Journal of Proteome Research 发表的研究 Ultrahigh-Throughput Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometry Method for Targeted Protein Degradation Compound Screening Using the Orbitrap Astral Mass Spectrometer，直接把这一问题推到了 300 samples per day。

作者开发了一套基于 Orbitrap Astral 的超高通量 LC-MS/MS 方法：即使在 300 SPD 条件下，也能够从单一人源细胞系获得接近 8000 个 protein groups，同时蛋白定量 CV 低于 10%。而在进一步优化的 8 cm column、300 SPD 方法中，作者分析 200 ng HeLa 和 K562 样品，其中HeLa鉴定7944 protein groups，K562鉴定7583 protein groups，且同时分别获得超过 60,000 和 57,000 peptide groups。

Fig.4 从方法优化出发，探索300样本/天的蛋白质组学分析。（点击查看大图）

从“测得快”到“筛得出”：300 SPD 用于靶向蛋白降解研究:

当然，高通量只有转化为真实生物学信息，才有意义。因此，该研究进一步将 300 SPD workflow 用于靶向蛋白降解（targeted protein degradation, TPD）研究。研究人员使用人 Jurkat T 细胞，以 8、40、200、1000 nM 四个浓度分别处理三种免疫调节药物

pomalidomide、iberdomide 和 mezigdomide；处理 24 h 后，通过 KingFisher-assisted SP3 样品制备和 300 SPD LC-MS/MS 工作流进行全蛋白质组分析。

Fig.5 从高通量质谱分析到靶向蛋白降解化合物筛选。

结果显示，三种化合物产生了不同的、剂量依赖性的蛋白降解模式。（点击查看大图）

已知 cereblon neosubstrates，例如 IKZF1 和 ZFP91，均出现预期的降解；其中 mezigdomide 在较低浓度下表现出更高效力。更值得注意的是，研究还观察到 mezigdomide 显著影响额外蛋白，其中包括 IKZF2。 论文作者进一步讨论了 IKZF2 与 regulatory T cell suppressive function 的关系，并提出这一更广泛的底物谱可能为 mezigdomide 的免疫调节作用提供新的机制解释。

Chapter 03

对于血浆蛋白质组学，挑战又完全不同。血浆拥有极宽的蛋白浓度动态范围。少量高丰度蛋白占据绝大部分蛋白质量，而许多潜在组织泄漏蛋白、免疫相关蛋白和候选生物标志物处于低丰度区域。因此，血浆研究的关键并不只是质谱仪本身。样品前处理方法决定了最终“看到的是哪一部分血浆蛋白质组”。

2026 年 Molecular & Cellular Proteomics 的研究 “If the Shoe Fits?”—Benchmarking Plasma Proteomic Sample-Preparation Workflows Across Human and Rat Biofluids，系统比较了八种样品前处理 workflow，覆盖：- neat approaches：SP3、STrap；- depletion：PerCA；- corona enrichment：MagNet HILIC、MagNet SAX、HILIC/SAX combination、Enrich-iST、ProteoNano。

研究同时比较 human plasma、human serum 和 rat plasma，并全部采用 Orbitrap Astral DIA-MS 进行分析。

其中 Throughput 方法的 active gradient 和 sample load 均约为 Discovery 的一半：26 min vs 50 min；150 ng vs 300 ng。 综合不同 workflow 和 LC-MS 方法，研究累计鉴定 了2726 种人源蛋白，3767 种大鼠蛋白

值得注意的是，rat plasma 在多种 enrichment workflow 中甚至获得了比 human biofluids 更高的蛋白鉴定深度；例如 MagNet enrichment 在 Discovery 方法下，人源样本约达到 1700 proteins，而大鼠血浆约达到 3000 proteins。

这意味着血浆蛋白质组 workflow 的表现具有明显的物种依赖性和样本类型依赖性。

Fig.6 不同血浆蛋白质组学工作流程的系统比较

（点击查看大图）

研究发现，从 Discovery 切换至 Throughput 方法后，蛋白质组深度存在明显下降。对于 enrichment workflows：human biofluids平均下降 28.9% ± 2.6%，rat plasma则平均下降 25.6% ± 2.6%，所以“更快”仍然存在代价。但在实际方法使用中，我们发现不同的workflow可能会实际上改变了最终可见蛋白质组的组成。因此，某些方法更有利于细胞来源蛋白，某些方法更有利于组织来源蛋白。故而在血浆蛋白质组研究中，实验设计应该从“我要研究什么”反推“应该采用什么 workflow”，而不是只根据一个最高 protein count 选择方法。这是一个非常值得重视的方法学转变。

Chapter 04

脑脊液（CSF）与中枢神经系统直接接触，因此长期以来都是神经退行性疾病生物标志物研究的重要样本。但与血浆类似，CSF 蛋白质组同样存在动态范围和低丰度蛋白检测挑战。

2026 年发表于 Diagnosis 的研究，使用不同的高分辨质谱平台分析 CSF 和脑组织样本。

在 cognitively normal pooled CSF 中Orbitrap Astral鉴定2199 proteins，其他高分辨质谱平台鉴定1100 proteins，二者的overlap为982 proteins，而合并可得到2317 proteins。

Fig.7在该研究采用的实验条件下,不同的高分辨质谱平台分析 CSF样本（点击查看大图）

AD CSF和脑组织样品中，六例 AD 患者 CSF 中Orbitrap Astral鉴定2147 proteins，其他高分辨质谱平台鉴定1112 proteins，其中 Astral 额外鉴定约 1170 种蛋白。在 AD brain tissue extract 中Orbitrap Astral鉴定4165 proteins，其他高分辨质谱平台鉴定3374 proteins，合并脑组织蛋白质组达到 4482 种蛋白。

同时，该研究将 Astral 获得的非病理 CSF 数据与三项既往研究整合，最终形成 5861 unique proteins 的combined CSF proteome，其中本研究增加了此前其他数据集中未报告的 558 proteins。不过，对这些结果同样不能过度解读为疾病 biomarker 已得到验证。作者自己也指出，样本量有限，特别是疾病相关差异仍需要更大的独立队列进行验证。

Chapter 05

前面的研究更多关注“能够看到多少蛋白”。而到了生物制药质量分析，评价体系发生了变化。

宿主细胞蛋白（host cell proteins, HCPs）是重组生物制品生产过程中来源于表达宿主的工艺相关杂质。残留 HCP 可能影响产品稳定性、免疫原性和安全性，因此属于需要监控的关键质量属性。传统 HCP 检测通常依赖 ELISA。它具有高通量优势，但不能提供完整的 protein-resolved 信息，并依赖抗体覆盖范围。LC-MS/MS 因此可以作为正交技术，为 HCP 提供蛋白质层面的鉴定和定量。但仅仅只考虑“鉴定了多少蛋白”远远不够。

在HCP鉴定中，我们还要考虑很多，比如鉴定错误是否得到控制，不同浓度下是否具有线性，定量是否准确，精密度如何，最低可以定量到什么水平等一系列问题，2026 年 Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis Open 发表的研究：Definitive benchmarking of DDA and DIA for host cell protein analysis on the Orbitrap Astral in a regulatory-aligned framework，正是围绕这些问题，对 Orbitrap Astral 上的 DDA 与 DIA 进行了系统 benchmark。

作者首先研究了DDA 和 DIA方法的差别，研究使用 CHO 来源的 stable isotope-labeled HCP（SIL-HCP）标准品，加入 NISTmAb 基质，构建七个 spike levels，每个样本均在 Orbitrap Astral 上分别进行 DDA 和 DIA 技术三重复分析。DDA 采用优化后的 Top80 方法；DIA 使用 4 Th non-overlapping precursor isolation windows。 此外，作者专门引入 deterministic protein inference，使不同数据集和软件版本间的 protein grouping 保持一致，并通过 entrapment strategies 对鉴定错误进行经验性评估。这使研究重点从简单的“DIA鉴定更多”转向了更完整的分析性能比较。

在鉴定性能方面，与DDA相比，DIA在蛋白水平增加约45%，肽段鉴定数量增加约68%，同时 missingness 显著降低。 DDA 鉴定到的蛋白中，87% 同时被 DIA 检测到；DDA 鉴定到的肽段中，96% 也被 DIA 检测到。与此同时，DIA 还额外提供了大量独有鉴定。 因此DIA对于低丰度、复杂背景中的杂质蛋白，数据完整性与覆盖深度具有优势。

Fig8. DDA与DIA覆盖与完整性比较

（点击查看大图）

除此之外，DIA 的 fold-change fidelity 更接近理想状态，蛋白鉴定数量只是第一层。作者进一步使用 hierarchical Bayesian regression 研究不同 spike-in level 下的 protein-level fold-change behavior。结果显示DIA 的group-level slope集中在理想值 1.0 附近，而DDA出现系统性的 slope compression，μβ约为0.8。也就是说，当真实 HCP 浓度发生变化时，DIA 测得的 fold change 整体上更接近理论变化；DDA 则存在一定程度的变化幅度压缩。

文章中将这种差异主要归因于两种方法的定量域不同。DDA在该研究中使用 MS1 extracted ion chromatograms 定量，因此在恒定的高丰度 mAb 背景中，co-eluting matrix ions 可能形成额外信号，使真实 fold change 被压缩。DIA则使用 MS2 fragment-ion intensities 进行定量，因此在这套实验设计下受到上述 precursor-domain interference 的影响较小。

Fig9. DDA与DIA定量性能比较

（点击查看大图）

线性方面，在global HCP content层面，两种采集策略实际上都表现出了很好的线性。DDA和DIA测量的total HCP abundance与理论值均达到：R² > 0.99。DDA和DIA均能够准确报告总体HCP含量；DIA的主要优势体现在更深的覆盖、更完整的数据、更好的fold-change fidelity以及低丰度杂质灵敏度。即这两种方法都能准确定量总 HCP，但 DIA可以将LLOQ 做得更低。在文献中这套实验体系中，DIA 的 practical lower limit of quantification 大约低了 2.7 倍。 文章中还进一步检查了22种high-risk HCP。在最低 spike level（L1，20 ng）下，DDA和DIA均定量到其中19/22种，其中一些蛋白两种方法结果相当接近，也有一些蛋白存在显著差异。故，“总体 HCP 含量准确”不等于“每一个蛋白的结果都可以在不同 acquisition mode 之间直接互换”。对于真正关注单个高风险 HCP 的生物制药质量研究，这一点可能比“总共鉴定多少蛋白”更值得注意。

写在最后：

1. Hendriks IA, Buch-Larsen SC, Rykær M, et al.

Extending single-cell proteomics from HeLa to small primary human immune cells.

Nature Communications, 2026.

DOI: 10.1038/s41467-026-77675-x.

2. Lin H, Yang Y-Y, Maity S, Sun Q, Wang J.

Ultrahigh-Throughput Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometry Method for Targeted Protein Degradation Compound Screening Using the Orbitrap Astral Mass Spectrometer.

Journal of Proteome Research. 2026;25:2761–2771.

DOI: 10.1021/acs.jproteome.5c01023.

3. Emery-Corbin SJ, Steele JR, Multari DH, et al.

“If the Shoe Fits?”—Benchmarking Plasma Proteomic Sample-Preparation Workflows Across Human and Rat Biofluids.

Molecular & Cellular Proteomics. 2026;25(8):101626.

DOI: 10.1016/j.mcpro.2026.101626.

4. Chatanaka MK, Pascual Lorén M, Wong CJ, et al.

Comparative proteomic analysis of cerebrospinal fluid and brain tissue using Orbitrap Astral and timsTOF Pro 2 platforms with data-independent acquisition.

Diagnosis. 2026.

DOI: 10.1515/dx-2025-0175.

5. Khalil S, Ho JTC, Plisnier M.

Definitive benchmarking of DDA and DIA for host cell protein analysis on the Orbitrap Astral in a regulatory-aligned framework.

Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis Open. 2026;7:100113.

DOI: 10.1016/j.jpbao.2026.100113.