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徐培辉

第一反应往往是：是不是柱间差异？但答案可能没有这么简单。

本次实验我们选用 Inclisiran 作为模型 siRNA，使用 Thermo Scientific™ DNAPac™ PA200 强阴离子交换色谱柱，在高温变性条件下使 siRNA 双链解离为 SS 和 AS 单链，并进一步分析 N-1、N+1、P=O、loss of L96 等相关杂质。

首先，我们使用常见的 Tris/高氯酸钠体系，在 pH 10.7 条件下对 3 个批次的 DNAPac PA200 进行测试，见图一。

结果发现一个值得关注的现象：部分杂质的分离表现存在明显差异，尤其是 AS 链与 N+1 杂质，在其中两个批次色谱柱上基本未得到有效分离。乍一看，这似乎指向了“柱间差异”。但继续分析后，一个更基础的问题浮现出来：pH 10.7，却用了 Tris？对于离子交换色谱而言，pH 不仅是一个数字，更直接影响分析物的电荷状态、保留和选择性。而原方法采用的 Tris 在 pH 10.7 条件下并不是理想的缓冲选择。这意味着，当方法工作在缓冲体系能力不足的区域时，即使只是较小的 pH 变化，也可能转化为色谱选择性的变化。因此，表面上看起来像是“不同色谱柱分离不一致”，背后真正需要解决的，可能首先是方法本身的稳健性。

基于这一思路，我们将关注点转向 CABS 和 CAPS。两者均能覆盖实验所需的 pH 10–11 区域，因此更适合这一高 pH 阴离子交换方法。随后，我们系统考察了：柱温、乙腈比例、流动相 pH、EDTA 浓度以及缓冲盐种类。最终优化条件确定为：pH 10.6的 CABS 缓冲体系，20% ACN ，1 mM EDTA·2Na ，柱温80 ℃。我们再次使用 3 个批次的 DNAPac PA200 进行测试。见图二。结果显示，难分离的 AS N+1 杂质与主峰之间 P/V 分别达到 1.08、1.04 和 1.00；SS 链与 N+1 杂质的 USP Rs 均高于 1.2。进一步进行连续三针测试见图三：主峰保留时间/峰面积 RSD <0.3%；AS N+1 杂质保留时间/峰面积 RSD <0.7%。即使面对较难分离的杂质，方法依然表现出了良好的重复性。

更有意思的是，当 CABS 更换为同样具有适宜缓冲能力的 CAPS 后，通过微调 pH为10.45，同样可以获得相似的杂质分离表现见图四。

从“追求分离度”走向“设计稳健的方法”小核酸杂质分析的难点，从来不只是“能不能把峰分开”。对于真正走向药物研发和 QC 的分析方法而言，更重要的问题是：今天能分开，明天还能不能分开？这一批柱子能分开，下一批还能不能保持一致？

更多详情见应用文章：AN_26047_CCS_制药_DNAPac PA200用于siRNA杂质高分辨率分析及方法稳健性研究

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