面对复杂样本中的未知物，如何获得更完整、更可信的结构信息？-新闻动态-赛默飞世尔科技（中国）有限公司

面对复杂样本中的未知物，如何获得更完整、更可信的结构信息？

发布时间：2026/7/10 8:29:12关注度：121

关注我们，更多干货和惊喜好礼

祝翔

复杂基质中的未知物注释，常常卡在两个问题上：1. 没有触发到潜在目标物的MS²信息；2. 即使采集到了 MS² 也未必足以定位结构差异。赛默飞 Orbitrap Tribrid “三合一”超高分辨质谱平台，通过其智能数据采集、多级碎裂、实时谱库搜索及多种碎裂方式，大大提升了未知物发现与结构注释的效率和置信度。

全新一代 Orbitrap Tribrid “三合一”超高分辨质谱平台硬件结构图（点击查看大图）

未知物注释，难点从来不只是“有没有峰”

在药物研发、代谢组学、食品与天然产物研究中，LC-MS 往往可以从复杂样本中发现大量特征峰。

但真正困难的是：这个峰是不是样本相关？它和母体化合物或某一类化合物有什么结构关系？MS² 信息够不够判断修饰位置、糖基连接方式或代谢位点？如果需要 MS³、MS⁴ 甚至正交碎裂信息，仪器方法又能否在有限的色谱峰宽内把关键数据采集到？

这正是 Orbitrap Tribrid 平台在未知物解析中发挥价值的地方。通过四极杆、线性离子阱与 Orbitrap 高分辨质量分析器的组合，既能获得高分辨精确质量信息，也能在同一套 LC-MS 方法中灵活采集 MSⁿ 结构信息。

药物代谢物鉴定，先把采集目标对准“真正相关”的离子

药物代谢物鉴定 MetID 的目标不只是找到代谢物，还要尽可能判断代谢修饰发生在什么位置。复杂生物基质中，背景离子、基质成分和低丰度代谢物同时存在。如果采用常规数据依赖采集，仪器时间可能被高丰度背景离子占用，真正需要碎裂的低丰度代谢物反而错过。

基于 Orbitrap Tribrid 质谱仪的药物代谢物鉴定工作流程示意图（点击查看大图）

AcquireX 背景排除

AcquireX 背景排除策略，先通过空白基质建立背景离子列表，记录 m/z、保留时间和峰强度等信息。后续分析含药物孵育样本时，方法会优先把 MS²/MSⁿ 采集资源投向样本中新出现的特征，也就是更可能与药物及其代谢物相关的离子。

在 nefazodone 氧化代谢物示例中，AcquireX 背景排除帮助低丰度代谢物获得碎裂数据，而不是让采集资源继续消耗在更强的背景信号上。相比传统采集方式，该类智能采集策略可通过增加药物相关代谢物的 MS² 触发，提高约 30-50% 的代谢物鉴定表现。

图示比较了保留时间 7.08 min 的奈法唑酮氧化代谢物（nefazodone + [O]）前体离子在未启用和启用 AcquireX 背景排除工作流程时的 MS/MS 采集结果。结果表明，自动生成的排除列表可有效避免对高丰度基质组分和背景离子的重复碎裂，将碎裂事件优先分配给低丰度奈法唑酮代谢物，从而提高代谢物鉴定效率（点击查看大图）

对于很多代谢物，仅有 MS² 谱图仍然不够。

以 nefazodone 氧化代谢物为例，MS² 中的主要碎片可能对应多个氧化位置，因此难以仅凭 MS² 判断修饰位点。借助 Orbitrap Tribrid 的多级碎裂能力，进一步触发 MS³ 后，文献中通过更具结构指向性的碎片离子，将氧化定位到 ethyl sidechain。

这类深度结构信息并不适合对所有离子盲目采集，否则会拉长循环时间、降低整体覆盖度。Met-IQ 工作流利用实时谱库搜索 RTLS，把实验 MS² 谱与母体化合物谱库进行相似性匹配。只有当未知物与母体药物呈现结构相关性时，才触发 MS³ 或其他后续扫描。

在 losartan 人肝微粒体孵育样本中，该策略让获得 MS³ 数据的 losartan 相关代谢物数量从传统 ddMS³ 实验的 10 个增加到 24 个。换句话说，仪器把更深层的碎裂时间花在了更值得解析的目标上。

对氧化奈法唑酮代谢物 MS³ 碎裂谱中的碎片离子进行归属分析，成功将氧化生物转化位点定位于乙基侧链

（点击查看大图）

在 Met-IQ 工作流程中，当 m/z 615 代谢物的 MS/MS 碎裂谱与氯沙坦母体化合物谱库表现出相似性匹配时，系统会自动触发选择性 MS³ 数据采集，从而获取更丰富的结构信息

（点击查看大图）

滑动查看更多

正交碎裂：当 HCD/CID 看不清时，UVPD 提供另一种结构视角

代谢物结构解析中，经常会遇到“碎了，但碎得不够有信息量”的情况。尤其是葡萄糖醛酸化、GSH 结合等较易断裂的修饰，HCD 或 CID 可能优先断开不稳定键，导致谱图中缺少能定位连接位置的关键碎片。

文中展示了 UVPD 紫外光解离在这类问题上的价值。以 diclofenac 酰基葡萄糖醛酸化代谢物为例，HCD 谱图难以确认葡萄糖醛酸连接位置，而 UVPD 产生的特征碎片可以支持酰基葡萄糖醛酸键的判断。对于两个氧化加葡萄糖醛酸化的同分异构代谢物，UVPD 谱图中含葡萄糖醛酸的特征碎片差异，也帮助区分氧化位点并确认连接信息。

这说明在复杂 MetID 任务中，多种碎裂方式并不是简单叠加，而是在不同结构难题上形成互补。

普萘洛尔葡萄糖醛酸结合物分别采用 HCD、CID 和 UVPD 进行碎裂分析得到的质谱图。图中重点标出了 UVPD 特有的、具有重要结构解析价值的碎片离子（点击查看大图）

双氯芬酸（上）及其葡萄糖醛酸代谢物（中）的 HCD 碎裂谱比较显示，HCD 未能产生足以确认葡萄糖醛酸结合位点的诊断性碎片离子。相比之下，UVPD 碎裂谱（下）基于 m/z 327 特征离子的碎片结构归属，成功确定了酰基葡萄糖醛酸键（acyl-glucuronide bond）的结构特征（点击查看大图）

比较了双氯芬酸两种氧化-葡萄糖醛酸化异构代谢物（M+[O]+[GlcA]）的 HCD 和 UVPD 碎裂谱。通过对图中重点标示的 UVPD 特征碎片离子进行结构归属，不仅能够区分两种异构体的氧化位点，还可确认其发生的是酰基葡萄糖醛酸化（acyl glucuronidation）（点击查看大图）

向上滑动查看更多

对于复杂样本中的未知物，精确质量数是起点，结构置信度才是终点。

从药物代谢物鉴定到化合物高通量注释，当高分辨检测、多级碎裂能力、智能采集策略、实时谱库搜索和结构预测软件结合在一起，未知物解析可以从“发现更多峰”进一步走向“获得更可信的结构答案”。

对于关注 MetID、天然产物、食品组学、植物代谢组学及复杂样本非靶向分析的实验室而言，这类 Orbitrap Tribrid 工作流提供了一条值得参考的路径：在同一次 LC-MS 分析中，尽可能采到更相关、更深入、更可解释的结构信息！

参考文献：

1. Comstock, K.; Du, M.; Jiang, M. Confident drug metabolite identification using an intelligent data acquisition and processing workflow. Thermo Fisher Scientific Application Note 65953, 2021. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/Application-Notes/an-65953-drug-metabolite-identification-intelligent-data-acquisition-an65953-en.pdf

2. Ruan, Q.; Comstock, K. A New Workflow for Drug Metabolite Profiling by Utilizing Advanced Tribrid Mass Spectrometry and Data-Processing Techniques. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2021, 32, 2050–2061. (doi: 10.1021/jasms.0c00436)

3. Wang, K.; Hackbusch, S.; Comstock, K.; Coe, K.J. Efficient and Comprehensive Metabolite Identification by Utilizing Automatic Background Exclusion and Specific Filtering Features of the Orbitrap ID-X Tribrid Mass Spectrometer. Proceedings of the 67th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Atlanta, GA, USA, June 2–6, 2019.

4. Bills, B.; et al. Novel Real-Time Library Search Driven Data Acquisition Strategy for Identification and Characterization of Metabolites. Anal. Chem. 2022, 94, 3749–3755. (doi: 10.1021/acs.analchem.1c04336)

5. Aoyama, R.; et al. Real-Time Library Search on Orbitrap IQ-X Tribrid MS Enhances Metabolite Profiling. Proceedings of the 69th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Philadelphia, PA, USA, October 31 - November 4, 2021.

6. Van Vleet, T.R; et al. Acyl glucuronide metabolites: Implications for drug safety assessment. Toxicol Lett. 2017, 272, 1–7. (doi: 10.1016/j.toxlet.2017.03.003)

7. Ruan, Q.; Comstock, K. Advanced Metabolite Profiling by using Tribrid Mass Spectrometry and Multiple Fragmentation Approaches. Proceedings of the 69th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Philadelphia, PA, USA, October 31 - November 4, 2021.

8. Wang, K.; Comstock, K.; Coe, K.J. Application of Ultraviolet Photodissociation (UVPD) as Effective Approach to Localize Glucuronide and GSH Conjugates on Orbitrap IQ-X Tribrid Mass Spectrometer. Proceedings of the 69th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Philadelphia, PA, USA, October 31 - November 4, 2021.