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张晓夕

糖基化是生物药最重要的翻译后修饰之一，直接影响蛋白质的结构稳定性、生物活性、药代动力学以及免疫原性。随着融合蛋白、双抗和ADC等复杂生物药的发展，如何同时实现糖基化、异构化以及多种关键质量属性（CQA）的精准表征，已经成为分析科学面临的重要挑战。

阿柏西普是一种高度复杂的融合蛋白，含有5个N-糖基化位点（图1）以及多个潜在O-糖基化位点，同时还存在Asp异构化、脱酰胺和氧化等多种翻译后修饰。传统糖链分析通常采用糖链释放结合荧光标记的方法，虽然适用于总糖型分析，但无法获得位点特异性的糖基化信息；而常规HCD碎裂在糖肽分析时往往优先断裂糖苷键，产生大量糖链碎片，却难以获得足够的肽骨架信息用于糖基化位点确认。

图1. 阿柏西普结构示意图

研究结果显示，无论采用Trypsin、LysC还是ArgC酶切方案，均能够获得100%的蛋白序列覆盖率。对于糖基化程度高、结构复杂的融合蛋白而言，这一结果具有重要意义，因为它意味着不仅能够完成常规肽段鉴定，还能够同步获取完整的翻译后修饰信息。

在糖基化分析方面，EThcD展现出明显优势。以N196位点糖肽为例，研究获得了丰富的c/z离子系列，同时保留了完整糖链信息。前体离子质量误差仅为−1.78 ppm，主要碎片离子质量误差均小于6 ppm。高质量精度不仅提高了鉴定可信度，也为糖链组成确认和位点定位提供了坚实依据（图2）。

图2. 肽段KN(196)STFVR （3+，m/z = 922.720， N-糖链 A2S1G1） 的 EThcD MS² 谱图。三价前体离子的全谱图及局部放大图均显示出丰富的诊断性 c/z 碎片离子（如 c₁–c₂ 和 z₅–z₆）、氧鎓离子（oxonium ions） 以及保留部分糖链结构的肽段碎片离子。这些碎片信息共同支持了肽段序列的准确鉴定和糖基化位点的精确定位。MS 和 MS/MS 谱图均表现出优异的质量精度（< 6 ppm）和较高的信噪比。（点击查看大图）

更值得关注的是平台表现出的检测灵敏度。研究中成功鉴定了N68位点一个相对丰度仅为0.68%的A3S3F高唾液酸化糖型（图3）。由于高度唾液酸化糖肽在正离子模式下通常电离效率较低，因此此类低丰度糖型往往难以获得高质量MS/MS数据。然而在Orbitrap Excedion Pro平台上，研究人员仍然获得了完整的c/z离子覆盖和准确的糖基化位点信息，所有关键碎片离子的质量误差均小于6 ppm。这表明该平台不仅能够覆盖高丰度糖型，也能够胜任痕量糖型的深入表征。

图3. 肽段 KGFIISN(68)ATYK（3+，m/z = 1417.591，N-糖链 A3S3F） 的 EThcD MS² 谱图。该糖型的相对丰度仅为 0.68%。三价前体离子的全谱图及局部放大图均显示出丰富的诊断性 c/z 碎片离子（如 c₆–c₈）、氧鎓离子（oxonium ions） 以及保留部分糖链结构的肽段碎片离子。这些碎片信息为肽段序列鉴定和糖基化位点定位提供了充分证据。MS 和 MS/MS 谱图均表现出优异的质量精度（< 6 ppm）和较高的信噪比，表明该平台即使对于相对丰度不足 1% 的低丰度糖肽，也能够获得高质量的 EThcD 碎裂谱图，实现可靠的结构解析和位点确认。（点击查看大图）

表1列出了阿柏西普中五个潜在糖基化位点相对含量前十的N-糖类型，可见各N-糖基化位点的糖型分布存在显著差异。对于 N36、N123 和 N196 位点，主要糖型均为高唾液酸化糖型。相比之下，N68 位点最丰富的形式为未糖基化肽段，而位于Fc结构域的 N282 位点则以 A2G1F、A2G0F 和 A2G2F 为最主要的三种糖型。进一步分析发现，在 VEGFR1结构域 的 N36 和 N68 位点，同时检测到了双天线和三天线高唾液酸化糖型；而在 VEGFR2结构域 的 N123 和 N196 位点，则以双天线高唾液酸化糖型占主导地位。这些结果表明，阿柏西普不同糖基化位点之间存在明显的位点特异性。如此复杂且高度异质的糖基化特征，也进一步凸显了采用 EThcD碎裂技术开展深度N-糖基化表征的重要性。EThcD不仅能够提供丰富的肽骨架碎片离子用于序列确认和位点定位，还能够保留糖链结构信息，从而实现复杂糖蛋白糖基化修饰的精准解析。表二列出了每个位点鉴定到的N-糖型数目，包含多种相对丰度小于0.1%的糖型，均可在三针重复进样中被检测到，证明了仪器平台优异的灵敏度。

EThcD对于O-糖基化分析同样具有独特价值。阿柏西普此前的研究主要集中于N-糖基化，而关于O-糖基化的直接实验数据十分有限。本研究成功检测到位于S12位点的O-糖肽（图4），糖型为Hex(1)HexNAc(1)NeuAc(1)。令人印象深刻的是，该糖肽相对丰度仅为0.037%，却依然获得了97.8的鉴定得分，并在三次重复实验中稳定检出。通过丰富的c6、c7、c8以及z12、z15等碎片离子，研究人员明确将糖基化位点定位于S12，而非肽段中的其他Ser/Thr位点。对于如此低丰度的O-糖肽，这种位点级别的确认充分体现了EThcD与高灵敏度Orbitrap平台的协同优势。

图4. ArgC酶切样品中肽段 PFVEMYS(12)EIPEIIHMTEGR（3+，m/z = 979.112， O-糖链Hex(1)HexNAc(1)NeuAc(1)）的 EThcD MS² 谱图。三价前体离子的全谱图及局部放大图显示出丰富的诊断性 c/z 碎片离子（如 c₆–c₈、z₁₂ 和 z₁₅）、氧鎓离子（oxonium ions） 以及保留部分糖链结构的肽段碎片离子。这些碎片信息共同支持了肽段序列的准确鉴定以及 O-糖基化位点的精准定位。尽管该 O-糖肽的相对丰度仅为 0.037%，EThcD 仍能够提供充分的骨架碎裂信息和糖链相关诊断离子，实现对痕量 O-糖基化修饰的可靠鉴定和位点确认。（点击查看大图）

除了糖基化分析，EThcD在Asp异构化表征方面的优势更加突出。Asp异构化被认为是许多生物药的重要质量属性之一，但传统HCD产生的b/y离子无法区分Asp和isoAsp，因为两者具有完全相同的质量。EThcD则能够产生特征性的c+57和z−57诊断离子对，从而直接确认异构化的发生及其具体位置 （图5A）。

研究中不仅成功鉴定了多个Asp异构化位点，而且能够对含有多个Asp残基的肽段实现精确定位。例如在肽段TTPPVLD(384)SD(386)GSFFLYSK中，研究人员通过特征z*−57离子成功区分了D384和D386两个不同的异构化位点。即使这些异构体的相对丰度低至0.016%和0.036%，依然能够获得足够质量的EThcD谱图完成可靠鉴定（图5B）。这对于生物药稳定性研究、可比性评价以及MAM分析具有重要价值。

在本研究中，研究人员实现了在同一个分析流程中，同时完成了N-糖基化、O-糖基化、Asp/isoAsp异构化、脱酰胺、氧化等多种关键质量属性的表征，并获得100%序列覆盖率。这种分析模式与当前生物制药行业广泛推广的MAM（Multi-Attribute Method）理念高度契合，为复杂生物药研发、工艺开发、质量控制以及生物类似药可比性评价提供了新的解决方案。

https://doi.org/10.1016/j.jpba.2026.117600

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