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文献分享：完整分子水平的多属性分析方法（intact MAM, iMAM）用于ARC的系统表征与质量控制

发布时间：2026/4/24 8:29:29关注度：107

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张晓夕

今天将要分享一篇客户发表在分析化学杂志（Analytical Chemistry）上的文章，该研究围绕抗体-siRNA偶联物（Antibody–siRNA Conjugates, ARCs）的分析方法开发展开。自2001年小干扰RNA（small interfering ribonucleic acids, siRNA）被发现以来，基于siRNA的治疗策略得到了迅速发展，目前已有多个药物获批上市并进入临床研究阶段。siRNA通过RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC）介导mRNA降解，从而实现对特定基因表达的高效抑制，在治疗多种疾病方面展现出重要潜力。然而，siRNA在临床应用中仍面临诸多挑战，例如递送效率低、体内稳定性差、脱靶效应以及免疫反应等问题。

为克服上述限制，抗体-siRNA偶联物（ARCs）被开发用于将siRNA精准递送至特定细胞、组织或器官。ARCs结合了抗体的靶向能力与siRNA的基因沉默功能，是一种具有前景的新型治疗模式。然而，这类分子同时包含蛋白质、大分子核酸及小分子连接子，其复杂的结构和理化性质差异给分析方法的建立带来了巨大挑战。

在分析层面，siRNA通常带有较强负电荷，在反相色谱中需要离子对试剂辅助分离；而抗体分析则通常采用不同的色谱和质谱条件。此外，在质谱分析中，抗体更适合在正离子模式下检测，而siRNA则更适合负离子模式，这使得ARC这种偶联体系的最佳电离条件变得不明确。同时，siRNA序列中的GC含量会影响其熔解温度，从而进一步影响其结构稳定性和分析行为。

近年来，基于质谱的多属性分析方法（Multi-Attribute Method, MAM）在生物制药领域得到广泛应用，可在单一分析中同时监测多个关键质量属性（CQAs），如纯度、修饰和药物负载比（DAR）等。然而，对于ARCs而言，由于其结构复杂，通常需要多种互补分析技术（如阴离子交换色谱和体积排阻色谱）才能全面表征，这增加了分析流程的复杂性和成本。因此，开发一种能够实现全面表征的统一分析方法具有重要意义。

基于此，本研究提出利用天然状态下的体积排阻色谱-质谱联用技术（native SEC-MS），开发一种完整分子水平的多属性分析方法（intact MAM, iMAM），用于ARC的系统表征与质量控制。该方法能够在保持分子非共价结构的条件下，对多种关键质量属性进行综合分析，并有望作为一种通用平台方法应用于ARC及相关生物大分子的表征与放行检测，如图1所示。

图1. ARC的电离行为对极性及序列的依赖性（左）及iMAM监控的ARC 关键质量属性（右）。（点击查看大图）

本文的研究中系统比较了正/负离子模式下ARC的电离行为，如图2所示。图2展示了四种偶联了不同siRNA的ARC样品（ARC-1，ARC-2，ARC-3，ARC-4）在正离子模式和负离子模式下分别采集的完整分子量数据解卷积谱图。由图中的信息可知，在正离子模式下， siRNA负电荷被中和，这有利于保持其双链结构并检测到更多含双链siRNA的 “完整ARC”。在负离子模式下，整体负电荷增加，静电排斥增强，使得siRNA双链更易解离，从而产生单链信号。由此可知，电离极性直接决定siRNA双链是否保持完整。

图2. 在正、负离子模式下，4种偶联不同siRNA序列的ARC的解卷积谱图。在正离子模式下，主要观察到含siRNA双链的完整ARC分子；而在负离子模式下，更多观察到缺失反义链（antisense strand, AS）的完整分子。随着AS中鸟嘌呤胞嘧啶（guanine cytosine, GC）含量的增加，在两种离子模式下检测到的完整siRNA双链比例也相应增加。各ARC中AS的GC含量大小规律为：ARC-1 < ARC-2 < ARC-3 < ARC-4。（点击查看大图）

偶联的siRNA序列组成同样会对ARC的离子化行为造成影响，如图3所示。从图中可以观察到，siRNA的GC含量或融化温度（melting temperature, Tm）与双链保留比例呈显著线性相关：GC含量越高，双链越稳定，质谱谱图中偶联了siRNA双链的完整ARC比例越高，在正负离子化模式下，其相关性R²均接近0.9。

图3. GC含量（GC%）或熔解温度（Tm）与在正、负离子模式下检测到的完整ARC分子比例之间的相关性。两种离子模式下均呈现良好的线性关系，表明随着GC含量或熔解温度的升高，检测到的含siRNA双链的完整ARC比例也随之增加。（点击查看大图）

由以上研究可知，影响ARC质谱行为的因素包括两大类：离子化模式和siRNA序列组成。

Native SEC-MS 策略作为身份验证方法的可行性评估

根据各个国家和地区监管机构的要求，对所有原料药及最终产品均需进行身份验证（identity testing），以确保产品的安全性及有效性。传统的身份验证策略是将样品的保留时间与标准品进行对比，但对于ARC这样的新型分子，此方法缺乏特异性。而本文中所开发的Native-ESC-MS 策略是一种新型的双因子身份验证策略（two-factor identity method），包括了两个维度的因子。第一个因子基于所有组分的完整分子量测定，包括AS 全缺失的ARC、完整 ARC和/或游离AS（完整AS和/或AS的序列特征性离子）；第二个因子基于 ARC的特征电离行为，包括正/负离子化模式下的响应差异以及与siRNA序列相关的影响。这两个因子为实现更高特异性的身份验证提供了额外的保证。

Native SEC-MS 策略作为iMAM的可行性评估

由于与质谱在线直连的native SEC需要使用醋酸铵作为流动相缓冲盐，为了与传统SEC方法进行桥接，研究人员对传统SEC体系和醋酸铵SEC体系对ARC进行色谱分离的表现进行了对比，如图4所示，对于对照组和加热强降组，两种方法均具有可比性。

图4. 传统分析型SEC与MS直连native SEC的UV数据比较。A，两种方法能够获得相似的SEC分离效果：采用乙酸铵作为流动相的MS直连native SEC（蓝色）与采用磷酸盐和氯化钠的分析型SEC（黑色）表现一致 (UV=260nm)。B，对于对照组和加热强降组样品，利用传统分析型SEC（UV=214 nm）与MS直连native SEC（UV=260 nm）测得的高分子量聚体（HMWS）、单体以及低分子量组分（LMWS）的百分比具有良好一致性。（点击查看大图）

图5展示了DAR1 ARC样品的游离半胱氨酸修饰、N-糖基化以及连接子水解表征结果。其结果证明Native SEC-MS 策略在单次分析中可同时表征多个CQAs，包括DAR分布、聚集体/片段（HMWS/LMWS）、N-糖基化、半胱氨酸修饰、linker水解和siRNA双链稳定性/解离等，可以实现从多方法到单平台的整合。

图5. DAR1 ARC中游离半胱氨酸修饰、N-糖基化及连接子水解的表征。A，解卷积质谱图中观察到的未偶联半胱氨酸的修饰情况以及多种N-糖基化形式。B，DAR1加热强降样品中两种组分的提取离子流图（EIC）。其中一种为连接子发生水解且未偶联半胱氨酸发生半胱氨酸化修饰的DAR1（黑色曲线），另一种为DAR1（蓝色曲线）。测得分子量与理论值一致（误差≤100 ppm）。（点击查看大图）

由于siRNA的双链解离也是ARC表征的关键质量属性之一，在本文的研究中，通过优化质谱条件（图6）和内标研究（图7）证明了Native SEC-MS 策略用于检测游离AS的能力，使用同一方法对siRNA-linker-1的鉴定能力也得到了证明（图8）。

图6. 减少LC-MS方法引入的游离siRNA相关杂质。在温和的LC-MS条件下，未检测到反义链（AS），表明由LC-MS方法引起的假性杂质可被有效避免。（点击查看大图）

图7. 利用SEC-MS和SEC-MS/MS区分游离siRNA相关杂质。A，检测波长为260 nm下的UV色谱图，可见游离反义链（AS）相较于ARC相关组分具有明显不同的保留时间，证明该方法能够准确识别游离siRNA杂质。
B，对ARC-5进行质谱分析，AS （电荷态−5）的MS/MS分析可获得100%的序列覆盖度。（点击查看大图）

图8. 在同一质谱图中检测到的siRNA-linker-1两条链的离子信号。解卷积基于检测到的单同位素离子进行，其质量误差分别为−1.8 ppm和5.9 ppm。（点击查看大图）

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工业化与GMP验证

方法在两个GMP实验室完成了验证，其重复性优异（RSD < 1%）且溶液具有良好的稳定性（5℃可稳定存放3天）。该方法已被成功应用于DS/DP放行检测。

总结

该研究通过native SEC-MS建立iMAM平台，将ARC复杂体系的结构解析、电离行为与质量属性监测统一到单一方法中，并揭示了序列与电离机制之间的内在关联。该iMAM方法已在两个GMP实验室中作为身份验证放行检测方法得到了验证，证明其可行性，并支持其在处理复杂新型药物分子的全球GMP检测实验室中的推广应用。

原文链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.5c06818

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