超高通量设计，样本处理效率跃升

HT SpaceM创新工作流程采用了激光刻蚀定制化多孔载玻片，将样本孔数量提升至40个，配合可拆卸的细胞制备腔室，经过全切片显微镜成像与AP-SMALDI5 AF & Q Exactive Plus Orbitrap质谱成像分析，结合细胞分割算法Cellpose和以及跨孔批处理分析，能够在同一块载玻片处理高达40个样品，每个样品可对超过1000个细胞进行分析，适用于各种细胞类型，大幅降低批次效应，极大地提高了单细胞级别代谢物检测的通量。

HT SpaceM 工作流程

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标准化数据分析框架，数据解读更系统

研究人员提出并验证了一套单细胞代谢组学数据分析框架，该框架整合了质量控制、无监督聚类、重复性评估、变异性分析、代谢物结构验证、富集分析与创新的单细胞共丰度代谢网络等分析方法。使用该框架，研究者能够更深入地理解多维度空间代谢组数据，识别保守代谢通路、枢纽代谢物以及细胞异质性。

HT SpaceM数据分析框架

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小分子代谢物高覆盖、高重现性分析

通过使用高精度的AP-SMALDI5 AF & Q Exactive Plus Orbitrap质谱成像平台，HT SpaceM能够在单细胞内检测到＞100种小分子代谢物，覆盖了主要的类别和通路小分子，包括氨基酸、核苷酸、脂肪酸和碳水化合物等。

高灵敏度与高可重复性是新兴SCM技术的核心要求。HT SpaceM在孔间与玻片间可重复性高，多数检测代谢物变异性低。同一载玻片内约76%的玻片内孔与孔之间相关系数（R）≥0.97，不同载玻片的样本相关性（R）仍高达0.88~0.99，且不受细胞系的影响，81.48%代谢物的CV值≤20%。HT SpaceM检测结果通过与常规液质联用Orbitrap Exploris 240代谢组学数据的对比，验证了工作流程的准确性。 

解析肿瘤细胞代谢异质性

使用HT SpaceM对9种NCI-60肿瘤细胞系（涵盖乳腺癌、结肠癌、肺癌等）和HeLa细胞进行分析，共检测到202种小分子离子。单细胞谱图的 UMAP 显示，细胞按细胞系清晰聚类，孔重复样本间可重复性高。进一步通过无监督聚类和“一对一”差异分析，揭示细胞系特异性标志代谢物。此外，富集分析可为代谢类别与通路的差异表达提供深入见解，结合代谢共丰度网络构建，有助于揭示关键代谢枢纽或协同代谢程序。

药物干预下的单细胞代谢动态

为了进一步探究HT SpaceM在药物研究中的适用性，研究人员对经糖酵解抑制剂2-DG处理12h、24h后的HeLa细胞分别进行谱图分析。HT SpaceM精准捕捉到明显的代谢变化，且变化符合2-DG的预期效应：葡萄糖积累、糖酵解抑制、柠檬酸水平升高等。单细胞代谢网络分析显示，多个通路中代谢协调关系发生改变，药物处理后以葡萄糖为中心重构代谢网络。聚类分析识别出三个细胞亚群，表明细胞对处理响应存在异质性，为药物响应差异研究提供新视角。 

HT SpaceM 基于MALDI质谱成像系统，解决了此前SCM 面临的核心痛点，提供高通量、可靠的SCM数据，使其特别适用于临床珍贵的样本，如循环肿瘤细胞、免疫细胞或活检样本等，为单细胞代谢组学高通量分析提供了全新的技术平台。

左：AP-SMALDI5 AF Orbitrap质谱成像系统

右：Orbitrap Exploris 240高分辨液质联用仪

AP-SMALDI Orbitrap质谱成像系统除了分析单细胞代谢物空间定位外，还可以作为一种进样方式，为单细胞代谢组学提供高通量定量分析。本研究采用AP-SMALDI5 AF & Q Exactive Plus Orbitrap质谱成像系统，其3μm高空间分辨确保可以实现单细胞水平分析，Orbitrap的超高分辨率、超高质量精度以及超高灵敏度，确保了低丰度小分子代谢物的可靠检测，为整个工作流程提供了核心硬件支撑。文中代谢物结构验证的LC-MS/MS分析，选用Orbitrap Exploris 240，其24万分辨率及Compound Discover数据库为代谢物注释提供了可靠的保障。