随着人们对健康管理的日益重视和糖尿病、肥胖等慢性疾病的发病率不断上升，替尔泊肽作为一种创新的 GIP/GLP-1 双靶点降糖药物，日益成为多肽药物领域的明星产品，亟需建 立可靠的杂质分析方法来确保这类药物的安全性和有效性。参考国家药品监督管理局药品 审评中心发布的《化学合成多肽药物药学研究技术指导原则（试行）》中“推荐采用不同 原理的分析方法进行多肽有关物质检查”的要求，本研究采用反相 (RP)色谱分离模式建立替尔泊肽有关 物质的液相色谱分析方法。
多肽药物可视为介于有机小分子与蛋白质大分子之间的一类特殊 药物[1]。多肽药物因其广泛的生物活性、高特异性和良好的安全 性等特点而日益受到关注[2]。多肽药物在治疗肿瘤、糖尿病、心 血管疾病、抗病毒和抗菌等多个方面具有显著疗效[3]。糖尿病作 为一种全球性的慢性疾病，不仅影响着患者的生活质量，还给社 会带来了沉重的经济负担。而肥胖，作为糖尿病的重要风险因素 之一，更是日益成为公共卫生关注的焦点。替尔泊肽的问世，无 疑为这一领域的治疗提供了新的思路和解决方案。作为且 目前的葡萄糖依赖性促胰岛素多肽 (GIP)/胰高血糖素样肽-1 (GLP-1) 双受体激动剂，替尔泊肽以其独特的双重作用机制和显 著的降糖、减重效果，为 2 型糖尿病患者和超重/肥胖人群带来了 新的希望。 随着多肽合成技术的不断进步，现代多肽药物的研发主要依赖于 化学合成。多肽药物由几十个氨基酸按照一定的顺序组合而成， 需要较多的合成步骤，由此产生复杂的杂质。多肽相关杂质（或 称有关物质）是指与目标分子结构有关的杂质，是反映多肽化学 纯度的重要指标之一。多肽相关杂质可能由起始物料引入，也可 能来自生产工艺副反应，或者在长期放置过程中由降解产生（包 括缺失肽、断裂肽、氧化肽等在合成过程中产生的工艺杂质，以 及由于多肽脱酰胺、氧化、水解、二硫键错配、消旋等不稳定因 素而产生的降解产物和聚合物）。多肽有关物质的存在不仅影响 药物的有效性，而且与药物的安全性息息相关。因此，建立合 适的方法对这些多肽相关杂质进行研究，是多肽药物质量控制的 关键。2023 年 2 月，国家药品监督管理局药品审评中心发布了 《化学合成多肽药物药学研究技术指导原则（试行）》[4]，对合成 多肽药物的药学研究提出了技术指导和要求。该技术指导原则中 指出，由于多肽相关杂质的结构、性质与主成分较为相似，采用 单一原理的分析方法可能无法完全分离多肽相关杂质，推荐采 用多种不同原理的检测方法进行有关物质评估，例如反相 HPLC 法、离子交换 HPLC 法、分子排阻 HPLC 法等[5]。 本文采用反相 (RP)、体积排阻 (SEC)、离子交换 (IEX)、亲水相互 作用色谱 (HILIC) 四种分离模式对 替尔泊肽及其有关物质进行分 析，待分离的有关物质种类包括 1 种插入肽、3 种脱酰胺杂质和 1 种差向肽杂质。方法建立过程中对色谱柱进行了筛选，并对多 种分离参数进行了优化。四种分析方法均获得了满意的峰形和杂 质分离效果，为分析替尔泊肽有关物质提供了多种有效的正 交分离手段。
实验部分 试剂和样品 甲醇、乙腈和三为色谱纯级，购于上海安谱实验科技有限 公司；磷酸二氢钠和磷酸氢二钠为分析纯级，购于默克；氯化 钠为优级纯级，购于国药集团化学试剂有限公司；实验用水为 Millipore Milli-Q 超纯水系统现制备的高纯去离子水。替尔泊肽为市 售商品，从国外获得；五种替尔泊肽相关杂质由国内客户提供。 仪器和设备 采用 Agilent 1260 Infinity II 生物惰性液相色谱系统，配备如下 安捷伦模块：四元泵（部件号 G5654A）、自动进样器（部件号 G5668A）、柱温箱（部件号 G7116A）和 VWD 检测器（部件号 G7114A）。 实验中使用的色谱柱见表 1。将 Agilent Buffer Advisor 软件用于 SEC、IEX 和 HILIC 分析方法的开发和优化。
标准品制备 替尔泊肽及 5 种肽相关杂质均易溶于水。取适量替尔泊肽和杂 质单标，分别用去离子水溶解，得到 1 mg/mL 溶液。向 1 mL 的 1 mg/mL 替尔泊肽溶液中依次加入 1 mg/mL 杂质单标溶液 10 μL，配制得到混合杂质加标溶液（各杂质含量约为 1%）。该 杂质加标溶液用于反相分析方法开发。 取适量替尔泊肽及杂质单标，分别用水和乙腈 1:1 (v/v) 混合溶液 溶解，得到 1 mg/mL 溶液。向 1 mL 的 1 mg/mL 的替尔泊肽溶 液中依次加入 1 mg/mL 杂质单标溶液 25 μL，配制得到混合杂质 加标溶液（各杂质含量约为 2.5%）。该杂质加标溶液用于 IEX 及 HILIC 分析方法开发。 在液相色谱分析过程中，将样品室温度控制在 8 °C。溶解后的样 品溶液于 4 °C 冷藏备用。
结果与讨论 方法一：反相色谱分析方法的建立与优化 目前，多肽药物有关物质分析大多采用反相液相色谱法，固定相以 C18 键合相为主。色谱柱的选择是方法开发过程中的关键步骤。本实 验基于 Agilent Poroshell 120 系列反相色谱柱进行方法开发。该系列色谱柱采用表面多孔核-壳填料颗粒，相对于全多孔颗粒具有更高的 柱效和分离度，同时该系列色谱柱具有十几种不同的反相键合相，可以为多肽有关物质分析方法开发提供不同的色谱柱选择。在实验过程 中，首先基于含 0.1% TFA 的水-乙腈体系筛选 5 种反相键合相，结果如图 1 所示。通过比较替尔泊肽峰形、分离出的杂质峰数量、替尔泊 肽和前后杂质的分离度及杂质间的分离度，发现 Poroshell 120 Bonus-RP 提供了最佳分离效果。
Poroshell 120 Bonus-RP 的键合相在烷基链中嵌入极性酰胺基 团，相较于 C18 键合相具有特殊的分离选择性。后续基于该色谱 柱进行了一系列分离条件的优化，包括流动相组成、流速、柱温 等。对于流动相组成的考察，首先比较了 50 mmol/L 磷酸盐体系 和 0.1% (v/v) TFA 体系对分离的影响。结果发现，在 50 mmol/L 的 磷酸盐体系中替尔泊肽主峰后分离出四种杂质，相较于 0.1% TFA 体系能够多分离出一种杂质。接着优化了磷酸盐的 pH 值，对比 了 pH 2.5、pH 3.5 及 pH 4.5 三种条件，结果如图 2 所示。从图 中可以看出，在 pH 3.5 下，替尔泊肽与 1 号杂质的分离效果最 ，后杂分离出的数量最多且后杂之间的分离度也最。实 验还发现，向流动相中加入少量 0.1% TFA，可以改善替尔泊肽与 1 号杂质的分离度。对添加的 0.1% TFA 的比例进行了优化，发 现其加入比例为 2.5% 时，既能提高替尔泊肽与 1 号杂质的分离 度，又能兼顾 4 个后杂之间的分离度。完成对流动相组成的优化 后，考察了流速对分离的影响。实验过程中洗脱梯度保持不变， 将流速分别设定为 1.6 mL/min、1.2 mL/min、0.8 mL/min 和 0.4 mL/min。结果发现，降低流速可以明显改善替尔泊肽和 1 号 杂质的分离，优化得到的最佳流速为 0.4 mL/min。对柱温进 行了考察。结果表明，柱温从 60 °C 降低至 50 °C 会导致分离的后杂数量减少，且 1 号杂质与替尔泊肽的分离度变差，说明高柱温条件更有利于替尔泊肽与有关物质的分离。因此，最终方法柱 温设定为 60 °C。通过以上色谱分离条件的优化，得到反相模式 下替尔泊肽混合杂质加标样品的谱图，如图 3 所示。从图中可以 看出，替尔泊肽与 5 种有关物质均实现了良好的分离。
结论 多肽有关物质的结构、性质与主成分非常相似，采用单一原理的 分析方法可能无法完全将其分离，因此《化学合成多肽药物药学 研究技术指导原则》中推荐采用不同原理的检测方法进行多肽有 关物质检测。本文针对热点多肽药物 ― 替尔泊肽及其有关物质建 立了反相、体积排阻、离子交换、亲水相互作用色谱四种不同机 理的液相色谱分析方法。反相色谱分析选择极性酰胺基团嵌入的 Poroshell Bonus-RP 色谱柱作为反相分析柱，进而通过优化流动 相组成、柱温、流速等一系列参数，成功将替尔泊肽与 5 种有关 物质分离。离子交换分析选用硅胶基质的强阳离子交换柱 Zorbax 300 Å SCX 作为分析柱，通过优化有机添加剂的比例、流动相 pH 值、柱温等参数，也成功分离出 4 种替尔泊肽有关物质。HILIC 分析采用具有独特键合技术的新型酰胺 HILIC 色谱柱进行方法开 发，通过优化流动相 pH 值、洗脱梯度、柱温等参数，最终使替 尔泊肽与 5 种有关物质实现分离。通过谱图和杂质相对保留时间 的对比，进一步验证了这三种不同原理的分析方法对替尔泊肽有 关物质的分离存在明显的选择性差异，可以互为正交分离手段。 对于替尔泊肽聚合物杂质的分析，本文采用 130 Å 孔径，具有独 特化学惰性处理技术的 AdvanceBio SEC 色谱柱进行方法开发， 通过筛选流动相体系，优化了多项色谱分离参数，取得了比较理 想的主峰峰形和杂质分离效果。
