本应用简报介绍了采用 Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统检测替丁类药物中的 N-亚 硝基二甲胺 (NDMA) 的方法。该方法可以有效避免替丁类药物受热不稳定而分解出亚硝胺 的问题，检测结果准确、重现性好、特异性强，且灵敏度优于 NDMA 目前的法规限量要 求（96 ng/天）。该方法适用于对盐酸雷尼替丁、枸橼酸雷尼替丁、尼扎替丁、西咪替丁等替丁类药物和制剂中的 NDMA 进行快速、准确的定量分析。
2019 年 9 月，FDA 爆出胃药雷尼替丁中含有超过限量要求的亚硝胺类致癌物 N-亚硝基二 甲胺 (NDMA)，随后出现大量涉及多个品牌的雷尼替丁药品召回事件[1]。这是继沙坦类药 物后，第二种被爆出含有超限量亚硝胺类杂质的药物，并使得监管机构对其它可能遭受污 染的化学合成药物越来越警惕。
(NDMA)，又称二甲基亚硝胺 (CAS 64-75-9)， 结构如图 1 所示，具有很强的肝脏毒性，属于亚硝胺类遗传毒性 杂质。根据世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单， NDMA 属于 2A 类致癌物，即“对人很可能致癌，此类致癌物对 人致癌性证据有限，对实验动物致癌性证据充分”[2]。根据 FDA 之前的评估结果，将 NDMA 可接受限量规定为 96 ng/天[3]。而 雷尼替丁 (Ranitidine) 的结构中含有亚硝胺类似基团（见图 1）， 根据 FDA 的研究[1]，其受热后会分解出 NDMA。因此，不适合采 用 GC-MS 检测雷尼替丁，而需要利用更温和的 LC-MS 技术。同 样，从结构角度来看，在其他替丁类药物的分析中也要考虑热不 稳定问题。 关于雷尼替丁中 NDMA 的检测，FDA 在 2019 年 9 月公布了 LC-HRMS 和 LC-MS/MS 方法[1]；欧洲 OMCL 实验室推荐采用 LC-MS/MS 方法[4]；同期，我国药品监管部门也发布了雷尼替丁 的推荐 LC-MS/MS 检测方法，并于同年 10 月，将方法扩展到 其他替丁类药物（枸橼酸雷尼替丁和尼扎替丁等）。值得一提的 是，在三大权威机构的推荐方法中，都用到安捷伦三重四极杆液 质联用系统。 本研究依据中国食品药品检定研究院替丁类药物中 NDMA 推荐检 测方法的要求，采用定量的准三重四极杆液质联用系统进行 测试。该方法有效避免了替丁类药物受热不稳定而分解出亚硝胺 的问题，灵敏度高、特异性强且重现性好，适用于定量分析盐酸 雷尼替丁、枸橼酸雷尼替丁、尼扎替丁、西咪替丁和法莫替丁等 替丁类药物中的 NDMA。
实验部分
试剂和样品 甲醇为质谱级，甲酸为色谱级，购自 Merck；所用实验用水为利 用 Millipore Milli-Q 超纯水系统现制备的高纯去离子水；NDMA 标 准品溶液及样品由合作用户提供。
仪器和设备 采用 Agilent 1290 Infinity II 超高效液相色谱系统与 6470 三重四极 杆质谱联用，其中色谱系统配备二元泵（部件号 G7120A）、自动 进样器（部件号 G7167B）和柱温箱（部件号 G7116B），质谱系 统配备大气压化学电离 (APCI) 离子源。为确保替丁类药物与 NDMA 有效分离，色谱柱选用 Agilent EclipsePlus C18 RRHD（3.0 × 150 mm, 1.8 µm，部件号 959759- 302）。
标样配制 取 NDMA 标准品溶液（1000 mg/L 甲醇溶液），用适当溶剂（与 样品前处理采用相同的溶剂）逐级稀释成每 1 mL 中分别含 1、 2、5、10、50、100、500 ng 标准品的溶液，作为校准标样。并 将 1 ng/mL 溶液稀释三倍，作为灵敏度测试溶液。
样品前处理 对于原料药，建议称取日最大摄入量。加 10 mL 水或甲醇（取决 于药物溶解度），振摇使其溶解后，离心，取上清液检测。 制剂和片剂经预先研磨后称重，胶囊则取内容物称重，建议称 取日最大摄入量。加 10 mL 水或甲醇（取决于药物溶解度），摇 匀涡旋混合 1 min，再振摇 40 min，离心后取上清液进行检 测。由于替丁类药物热稳定性差，因此应避免使用可能产热的剧 烈操作（如超声等）。 液相色谱条件 色谱柱： EclipsePlus C
在灵敏度测试中，方法检测下限轻松达到 0.33 ng/mL，定量离 子信噪比 (peak to peak) 为 8.5，同时可以观察到定性离子，结果 如图 4 所示。值得一提的是，为减少高浓度药品对色谱系统的污 染，在仪器灵敏度足够高的前提下，本实验仅采用 2 μL 的进样 量。以雷尼替丁为例，配制浓度为 30 mg/mL 的雷尼替丁原料药 及制剂，本方法的灵敏度可达 0.01 ppm，远优于目前日摄入量下 NDMA 的毒理学限量标准。
本研究考察了低、中、高浓度点标准品溶液连续进样的重现性， 所得到的分析物的峰面积相对标准偏差 (RSD) 分别为 1.78%、 0.90% 和 1.34%，表明该方法具有良好的重现性。
样品处理及加标回收率 研究考察了盐酸雷尼替丁、枸橼酸雷尼替丁、尼扎替丁、西咪替 丁和法莫替丁等替丁类原料药和制剂。对于不同替丁类药物，建 议根据 API 的溶解性（例如，盐酸雷尼替丁的甲醇溶解性更高， 而枸橼酸雷尼替丁的水溶性更高）选取最适合的溶剂。由于替丁 类药物热不稳定，且受热会分解出 NDMA，因此对于片剂和胶囊 类制剂，应采用振摇等温和的提取条件。 在本研究中所用的色谱条件下，NDMA 与替丁类药物完全分离， 不同浓度下各种药物的加标回收率均在 80%–120% 之间。以盐酸 雷尼替丁加标实验为例，不同浓度下得到的加标回收率见表 2， 结果均在 86.9%–102.3% 之间，满足准确度要求。
结论 本研究采用配备 APCI 离子源的 6470 三重四极杆液质联用系统 检测替丁类原料药及其制剂中的亚硝胺类杂质 NDMA。该方法稳 定、特异性强，且灵敏度优于目前限量检测要求。研究考察了不 同药物及剂型。这些样品经过适当的前处理，均可实现有效分离 并获得 80%–120% 的加标回收率，准确定量分析样品中的低浓度 杂质。该方法非常适合对大批量替丁类药物中的 NDMA 进行常规 定量分析。
