人白细胞介素6(IL-6)Elisa分析检测试剂盒操作方法-新闻动态-上海仁捷生物科技有限公司

人白细胞介素6(IL-6)Elisa分析检测试剂盒操作方法

发布时间：2018/1/29 16:29:53关注度：3183

人白细胞介素6(IL-6)elisa试剂盒

使用说明书

用途

本试剂盒仅供科研使用，定量检测细胞液、体液、组织、血清、血浆等标本中人白细胞介素6(IL-6)的含量。

原理:

采用双抗体夹心法测定人白细胞介素6(IL-6)水平。用纯化的人白细胞介素6(IL-6)抗体包被微孔板，制成固相载体，实验时依次在微孔板中加入样本及标准品，并加入HRP标记的白细胞介素6(IL-6)抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，反复洗涤后加底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化为蓝色，再用硫酸终止反应，转变成黄色。颜色的深浅和样品中的白细胞介素6(IL-6)含量呈正相关。采用酶标仪在450nm波长测定吸光度（OD值），根据标准曲线，计算测试样品中白细胞介素6(IL-6)浓度。

试剂盒组成

序号	名称	规格
1	酶标包被板	96孔*1可拆卸板
2	酶标试剂	6ml*1瓶
3	标准品(浓度40ng/L)	0.6ml*1瓶
4	标准品稀释液	2ml*1瓶
5	生物素标记的抗IL-6抗体	1.5ml*1瓶
6	显色剂A液	6ml*1瓶
7	显色剂B液	6ml*1瓶
8	终止液	6ml*1瓶
9	浓缩洗涤液（*30）	20ml*1瓶
10	封板膜	1张
11	使用说明书	1份

实验材料与试剂配制：

1. 仪器与材料：酶标仪（使用前预热30分钟），微量加液器、吸头、蒸馏水或去离子水，滤纸。

2. 洗液的配制：按1:30的比例配制洗液备用。

样品收集、处理及保存

1. 细胞培养上清：适用于检测体外培养的细胞分泌性成份。用无菌管收集细胞上清液，以1000×g离心15分钟，收集上清。

2. 细胞：用PBS反复洗涤细胞3次，调整细胞浓度达到10⁴-10⁶/ml 左右，通过反复冻融，使细胞破坏并放出细胞内成份，或者细胞超声粉碎，离心取上清液检测。

3. 血清：在室温下，血液自然凝固，以1000×g离心15分钟，取上清待测。

4. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合后静置10-20 分钟后，以1000×g离心15分钟，收集上清。

5. 体液：包括胸腹水、脑脊液，分泌物等。使用不含热原和内毒素的离心管收集，以1000×g离心15分钟，收集上清。

6. 组织标本：切取组织标本，称取重量0.05g，加入500ul 的PBS，用手工或匀浆器，或超声破碎仪将标本匀浆，以2000-3000 rmp离心20 分钟，收集上清进行检测。

7. 样品中不能含有NaN3，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

8. 保存：如果样品不能立即检测，应将其分装，-70 ℃保存，避免反复冷冻。保存过程中如出现沉淀，应再次离心。血液标本尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中含大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

操作步骤：

1. 取出试剂盒，室温（20-25℃）放置30分钟。

2. 分组：取出96孔板，根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数，把剩余的板条继续冷藏处理。分别设标准品组（6个浓度）、空白孔、待测样品组。

标准品的稀释：准备小试管6 只，依次编好号码，先在各小试管中加入标准品稀释液100ul，然后取原浓度标准品100ul 加入一只已编好号的试管中，充分混匀;再在该试管中取100ul 加入第二支试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul 加入第三只试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul 加入第四只试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul 加入第五只试管中，充分混匀；然后在该试管中取100ul，弃掉。第六只试管作为0 号标准品。稀释后各管浓度分别是：20ng/L,10ng/L,5ng/L,2.5ng/L,1.25ng/L ,0ng/L。

注：为减少实验误差，保证准确性，建议设置复孔。

3. 加样：依照标准品的顺序分别加入50ul的标准品溶液于空白微孔中；空白对照孔加入50ul的蒸馏水；其余微孔中先加样品40ul然后再加生物素标记的抗IL-6 抗体10ul。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

4. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。

5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复5 次，拍干。

6. 加酶标溶液：标准品组、待测样本组各孔中加入50ul的酶标溶液（空白对照孔除外）。

7. 温育：酶标板用封板纸密封后，放入湿盒内于37℃恒温孵育1小时。

8. 洗板：用稀释后的洗涤液注满每孔，静置15-30s，充分清洗酶标板5次，用吸水纸彻底拍干。

9. 显色：各孔加入显色剂A液50ul后，再加入显色剂B液50ul。

10. 终止：25-37℃下避光反应10-15分钟，加入50ul终止液。

11. 读板：在450nm波长读取各孔的OD值。

注：读板时必须拭干板底残留的液体和手指痕迹，读板时间控制在终止反应后的30分钟内，以免影响准确性。

数据计算

绘制标准曲线：各标准品OD值减去底色即减去空白孔OD值，以6个标准品的OD值为纵坐标y，以标准品的浓度为横坐标x，绘制曲线图，如图示，并计算出回归方程y=ax+b。

将待测样品的OD值代入方程式，计算各组样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际IL-6浓度。

敏感度：0.1ng/L

注意事项：

1. 实验操作中必须使用一次性吸头，避免交叉污染。

2. 加样：加样时，要控制加样速度，避免第一孔与最后一孔间的时间间隔过大，否则将会导致不同的预孵育时间，从而影响实验的准确性以及重复性。

3. 孵育：严格按照说明书上规定的孵育时间和温度进行。

4. 反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化，如果颜色较深，请提前加入终止液终止反应。

5. 建议实验前预测样品含量，如样品浓度过高，应对样品进行稀释，计算结果时乘以相应的稀释倍数。

6. 建议使用本试剂盒时先做预实验（即先做标准曲线，试用几个标本），如果对本试剂盒有任何疑问，可和所购经销商联系，如果因运输过程导致试剂盒失效，可要求调换，但概不承担产品本身以外的任何损失。

安全性

1．避免人体直接接触显色剂A、B和终止液。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。

2．实验中不要进食、抽烟或使用化妆品。

3．不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。

保存条件及有效期：

1.试剂盒保存：2-8℃

2.有效期：6个月

关键字：白细胞介素6检测试剂盒

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