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公司新闻
几丁质酶活性检测试剂盒说明书-微量法-赫澎生物研选
点击次数：249发布时间：2021/4/21 16:08:34
几丁质酶活性检测试剂盒说明书
微量法
注意：正式测定务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。
货 号 ：YX-W-B616
规格：100T/48S
产品内容：
提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。
试剂：液体 15mL×1 瓶，4℃保存，使用摇匀。试剂二：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。
标准品：粉剂×1 瓶。5mg N-乙酰氨基葡萄糖，4℃保存。临用加入 2.27mL 蒸馏水配成
10μmol/mL 的标准溶液。
产品说明：
几丁质酶要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官(例如乌贼的软骨)，以及真菌类的细胞壁中。而几丁质酶(EC 3.2.1.14)可催化几丁质水解，具有抵御真菌侵染的作用，成为抗真菌病害的研究热点。
几丁质酶水解几丁质产生 N-乙酰氨基葡萄糖，进步与 3,5-二硝基水杨酸产生棕红色化合物， 在 540nm 处有特征吸收峰，吸收值增加速率反映了几丁质酶的活性。
自备实验用品及仪器
天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵/匀浆器、蒸馏水。
操作步骤：
、粗酶液提取
1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积 (mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入
1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃离心 20min，取上清，置冰上待测。
2. 真菌：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3s，间隔 7 s，总时间 3min）；然后 10000g，4℃，离心 20min，取上清置于冰上待检。
3. 培养液：直接测定。二、测定操作表
1、可见分光光度计/酶标仪预热 30min。波长调至 540nm，蒸馏水调零。
2、将标准溶液稀释为 5、4、3、2、1μmol/mL 的标准溶液备用。
3、在 EP 管中分别加入：
| 试剂名称 | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
| 样品（μL） | 100 | 100 | - | - |
| 标准溶液（μL） | - | - | 100 | - |
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| 蒸馏水（μL） | - | - | - | 100 |
| 试剂（μL） | 100 | - | 100 | 100 |
| 混匀，37℃水浴 1h，沸水浴 5min。 | ||||
| 试剂（μL） | - | 100 | - | - |
| 8000rpm 常温离心 10min，分别取上清液 160μL 于新的 EP 管中，再加入下列试剂 | ||||
| 试剂二（μL） | 40 | 40 | 40 | 40 |
| 混匀，沸水浴反应 10min，立即置于冰上至室温。于微量玻璃比色皿或 96 孔板中测定每管在 540nm 下的吸光度，记为 A 测定管、A 对照管、A 标准管、A 空白管。计算ΔA 测定=A 测定管-A 对照管，ΔA 标准=A 标准管-A 空白管。 | ||||
三、计算公式
1、标准曲线的绘制：
以ΔA 标准为 y 轴，标准溶液浓度为 x 轴，绘制标准曲线，得到标准方程 y=kx+b。将ΔA 测定带入标准方程中，得到 x（μmol/mL）
2、几丁质酶活的计算：
（1） 按照样本重量计算
酶活性定义：37℃下，每 g 组织每小时分解几丁质产生 1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为个酶活性单位。
几丁质酶活性（U/g 鲜重）=x×V 样÷（V 样÷V 样总×W）÷T=x÷W。
（2） 按照蛋白质浓度计算
酶活性定义：37℃下，每 mg 蛋白每小时分解几丁质产生 1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为个酶活性单位。
几丁质酶活性（U/mg prot）=x×V 样÷（V 样×Cpr）÷T =x÷Cpr。
（3） 按照细胞数量计算
酶活性定义：37℃下，每 104 个细胞每小时分解几丁质产生 1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为个酶活性单位。
几丁质酶活性（U/104 cell）=x×V 样÷（V 样÷V 样总×细胞数量）÷T =x÷细胞数量。
（4） 按照培养液体积计算
酶活性定义：37℃下，每 mL 培养液每小时分解几丁质产生 1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为个酶活性单位。
几丁质酶活性（U/mL）=x×V 样÷V 样÷T =x。
V 样：反应体系中样本体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g；
Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，1h；细胞数量：以万计。
注意事项：
1、反应结束后尽快进行比色。
2、OD 值大于 1.5，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数；或者缩短 37℃水浴时间到X 小时（如 0.5 小时），按照原先计算公式得到的结果再除以 X。
