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公司新闻
超氧阴离子(Oxygen free radical, OFR)试剂盒说明书 微量法 100T/96S
点击次数：146发布时间：2020/9/15 10:10:20
超氧阴离子(Oxygen free radical, OFR)试剂盒说明书
微量法 100T/96S
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
生物体内超氧阴离子等活性氧具有免疫和信号传导的作用，但积累过多时会对细胞膜及生物
大分子产生破坏作用，导致机体细胞和组织代谢异常，从而引起多种疾病。
测定原理：
超氧阴离子与盐酸羟胺反应生成 NO2
－，NO2
－在对氨基苯磺酸和 α－萘胺的作用下，生成红
色的偶氮化合物，在 530nm 处有特征吸收峰，根据 A530 值可以计算样品中 O2
－含量，反应
式为 NH2OH + 2O2
－ ＋H
＋ → NO2
－ ＋ H2O2 ＋ H2O。
自备实验用品及仪器：
天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、氯仿和蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 8mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体 6mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂三：液体 6mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂四：氯仿，自备。
超氧阴离子提取
1. 植物、动物组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约
0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后，10000g，4℃，离心 20min，取上
清置于冰上待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建
议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7
秒，总时间 3min）；然后 10000g，4℃，离心 20min，取上清置于冰上待测。
3. 血清或培养液：直接测定。
测定操作表
1、 分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长至 530nm。
2、操作表
空白管 测定管
样本（μL） 40
提取液（μL） 100 60
试剂一(μL) 80 80
混匀，37℃水浴 20min
试剂二（μL） 60 60
试剂三（μL） 60 60
混匀，37℃水浴 20min
试剂四（μL） 100 100
混匀，8000rpm，25℃，离心 5min，小心吸取上层水相 200μL 于微量石英比色皿/96 孔板中，
空白管调零，测定 530nm 处吸光值，记为 A530。
超氧阴离子含量计算公式
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y=0.0115x-0.0038，R
2
=0.9986
1. 组织：
（1）按照样本质量计算
超氧阴离子含量（μmol/g）= (A530+0.0038)÷0.0115×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)×10-3
×2
= 1.74×(A530+0.0038)÷W
超氧阴离子产生速率（μmol/ g·min）=1.74×(A530+0.0038)÷W÷T
=0.087×(A530+0.0038)÷W
（2）按照蛋白质浓度计算
超氧阴离子含量（μmol/mg prot）= (A530+0.0038)÷0.0115×V 反总÷(V 样×Cpr)×10-3
×2
=1.74×(A530+0.0038)÷Cpr
超氧阴离子产生速率（μmol/ mg prot·min）=1.74×(A530+0.0038)÷Cpr÷T
= 0.087×(A530+0.0038)÷Cpr
2. 细菌，真菌：
超氧阴离子含量（µmol/104
cell）= (A530+0.0038)÷0.0115× V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数
量)×10-3
×2
= 1.74×(A530+0.0038)÷细胞数量
超氧阴离子产生速率（µmol/mg prot·min）= 1.74×(A530+0.0038)÷细胞数量÷T
= 0.087×(A530+0.0038)÷细胞数量
3. 血清或培养液
超氧阴离子 含量（μmol/L）= (A530+0.0038)÷0.0115 × V 反总÷V 样×2= 1739.13×(A530+0.0038)
超氧阴离子产生速率（μmol/L·min）= 1739.13×(A530+0.0038) ÷T= 86.96×(A530+0.0038)
V 样总：加入提取液体积，1 mL； V 反总：反应总体积，0.4mL；V 样：反应中样品体积，
0.04mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；T：反应时间，20min；2: 2
分子 O2
－参与反应生成 1 分子 NO2
－。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y=0.00575x-0.0038，R
2
=0.9986
1. 组织：
（1）按照样本质量计算
超氧阴离子含量（μmol/g）= (A530+0.0038)÷0.00575×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)×10-3
×2
= 3.48×(A530+0.0038)÷W
超氧阴离子产生速率（μmol/ g·min）=3.48×(A530+0.0038)÷W÷T
=0.174×(A530+0.0038)÷W
（2）按照蛋白质浓度计算
超氧阴离子含量（μmol/mg prot）= (A530+0.0038)÷0.00575×V 反总÷(V 样×Cpr)×10-3
×2
= 3.48×(A530+0.0038)÷Cpr
超氧阴离子产生速率（μmol/ mg prot·min）= 3.48×(A530+0.0038)÷Cpr÷T
=0.174×(A530+0.0038)÷Cpr
2. 细菌，真菌：
超氧阴离子含量（µmol/104
cell）= (A530+0.0038)÷0.00575× V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数
量)×10-3
×2
= 3.48×(A530+0.0038)÷细胞数量
超氧阴离子产生速率（µmol/104
cell·min）= 1.74×(A530+0.0038)÷细胞数量÷T
=0.174×(A530+0.0038)÷细胞数量
3. 血清或培养液
超氧阴离子 含量（μmol/L）= (A530+0.0038)÷0.00575 ×V 反总÷V 样×2= 3478.26×(A530+0.0038)
超氧阴离子产生速率（μmol/L·min）= 3478.26×(A530+0.0038) ÷T= 173.91×(A530+0.0038)
V 样总：加入提取液体积，1 mL； V 反总：反应总体积，0.4mL；V 样：反应中样品体积，
0.04mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；T：反应时间，20min；2：2
分子 O2
－参与反应生成 1 分子 NO2
－。
注意事项
1、 OD 值大于 1.5，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数。
2、 样品制备好后，立刻进行测定，请勿将样品进行长时间的低温保存，以免影响测定结果。
3、 试剂四有一定的毒性，请操作时做好防护措施。
4、 最低检出限为 0.33µmol/L。
