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技术文章
β-葡聚糖(β-Glucan）试剂盒说明书微量法100 管/48样使用方法你知道吗？
点击次数：2797 发布时间：2024/7/30 11:05:28
β-葡聚糖(β-Glucan）试剂盒说明书
微量法 100 管/48 样
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
β-葡聚糖是由葡萄糖单位组成的多聚糖，它们大多数是通过β- 1,3结合，天然存在于真菌、细菌和植物的细胞壁中。
测定原理：
依次使用地衣聚糖酶和β-葡萄糖苷酶水解β-葡聚糖生成葡萄糖，然后使用 GOD-POD 试剂测 定葡萄糖的含量。
需自备的仪器和用品：
酶标仪、水浴锅、可调式移液器、96 孔板、研钵、乙醇和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
试剂一：液体 60mL× 1 瓶，4℃保存；
试剂二：液体 150μL× 1 瓶，4℃避光保存；临用前加入 3mL 试剂一，充分溶解待用，用不 完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂三：液体 60mL× 1 瓶，4℃保存；
试剂四：液体 12mL× 1 瓶，4℃保存；
试剂五：粉剂× 1 瓶，4℃避光保存；临用前加入 6mL 试剂四，充分溶解待用，用不完的试 剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂六：液体 12mL× 1 瓶，4℃避光保存；
试剂七：液体 12mL× 1 瓶，4℃避光保存。
样品测定的准备：
1 、燕麦、小麦、纤维等干样：
样本充分烘干粉碎，过 40 目以上筛。取 0.05g 左右样本，加入 1mL 80%乙醇，充分震 荡混匀后，95℃水浴加热 5min 。取出冷却至室温，25℃ 3000g 离心 10min ，去除上清。
沉淀中加入 0.8mL 试剂一，充分震荡混匀，95℃水浴加热 5min 。取出冷却至室温，加 入 50μL 试剂二，混匀后 50℃反应 60min。
反应结束后加入 1mL 试剂三，充分混匀，25℃ 5000g离心 10min ，取上清待测。
2 、发酵液等液体样本：
取 0.5mL 样本，95℃水浴加热 5min 。取出冷却至室温后，分次缓慢加入 0.8mL 95%乙 醇，充分混匀，25℃ 3000g 离心 10min ，去除上清。沉淀中再加入 0.8mL 50%乙醇，混匀后 再次25℃ 3000g 离心10min ，去除上清。
沉淀中加入 0.8mL 试剂一，再加入 50μL 试剂二，混匀后 50℃反应 60min。反应结束后 加入 1mL试剂三，充分混匀，25℃5000g离心 10min ，取上清待测。
测定步骤
1 、酶标仪预热 30min ，调节波长至 505nm。
2 、显色液配制：临用前将试剂六和试剂七按1:1的比例混合，用多少配多少
3 、按下表在 EP 管中加入如下试剂：
试剂名称(μL） | 测定管 | 对照管 |
样本 | 100 | 100 |
试剂四 |
| 100 |
试剂五 | 100 |
|
37℃反应 20min ，然后 3000g 离心 5min ，取上清液待用 | ||
在 96 孔板中加入如下试剂
试剂名称(μL） | 测定管 | 对照管 |
上清液 | 20 | 20 |
显色液 | 180 | 180 |
充分混匀，37℃反应 30min ，测定 505nm 处吸光值，记为 A对照和 A 测定，△A=A 测定-A 对照。
β-葡聚糖含量计算：
标准条件下测定回归方程为 y = 2.321x + 0.0053 ，R2 = 0.9999；x 为标准品浓度（mg/mL）， y 为吸光值。
1 、按样本质量计算
β-葡聚糖含量(mg/g 干重)=(ΔA- 0.0053) ÷2.321×V1÷(W ×V2÷V3)
= 1.594×(ΔA-0.0053) ÷W
2 、按样本体积计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1nmol 对硝基酚定义为一个酶活力单位。 β-葡聚糖含量(mg/mL)=(ΔA- 0.0053) ÷2.321×V1÷(V4×V2÷V3)
= 3.188×(ΔA-0.0053)
V1：反应总体积，0.2mL；V2：反应体系中样本体积，0. 1mL；V3:提取液总体积，1.85mL； V4：液体样本体积，0.5mL；W：样本质量，g。
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
