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技术文章
HEPENGBIO植物高质纯化线粒体分离试剂盒实验步骤参考说明书
点击次数：2673 发布时间：2024/7/23 11:38:05
HEPENGBIO植物高质纯化线粒体分离试剂盒产品说明书
主要用途
HEPENGBIO植物高质纯化线粒体分离试剂是一种旨在从植物细胞或组织中分离出完整而高度纯化的活性线粒体细胞器的技术方法。适合于各种新鲜植物组织，包括叶片（leaf）、谷粒（grain）、种子（seed）、以及培养细胞的高纯线粒体的制备。其制备物产量高，活性保证，纯度可达99％。可以被用于线粒体酶活性、细胞凋亡、信号传递、代谢和蛋白组学等的研究。产品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能稳定，分离产量和纯度佳。
技术背景
线粒体细胞器的分离是现代细胞生物学研究的最常用的手段之一。从任何组织或细胞分离线粒体的技术方法基本上采用：一，通过机械或化学方法破裂细胞；第二，通过低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞器；第三，通过高速差速离心获得线粒体；甚至，第四，可以通过等密度离心获得纯度更高的线粒体。
产品内容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 100毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 300毫升
HEPENGBIO净化液（Reagent C） 80毫升
HEPENGBIO活性液（Reagent D） 1.5毫升
HEPENGBIO保存液（ReagentE） 50毫升
HEPENGBIO高纯液A（ReagentF1） 40毫升
HEPENGBIO高纯液B（ReagentF2） 35毫升
HEPENGBIO高纯液C（ReagentF3） 15毫升
产品说明书1份
保存方式
保存HEPENGBIO净化液（Reagent C）和HEPENGBIO活性液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，HEPENGBIO高纯液（ReagentF），避免光照；6
用户自备
50毫升锥形离心管：用于样本操作的容器
2毫升离心管：用于样本操作的容器
4℃台式离心机：用于样本操作
4℃超速离心机：用于样本操作
飞利浦手持式搅拌机：用于样本操作
50毫升DOUNCE匀浆器：用于裂解组织细胞
实验步骤
一、植物组织线粒体分离
实验开始前，将试剂盒里的HEPENGBIO净化液（Reagent C）和HEPENGBIO活性液（Reagent D）冻融，然后移取140微升HEPENGBIO活性液（Reagent D）、7毫升HEPENGBIO净化液（Reagent C）和28毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到50毫升锥形离心管里，混匀后，标记为HEPENGBIO裂解工作液，置入冰槽里备用。然后进行下列操作。
1． 准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定1.5克组织重量
2． （选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
3． （选择步骤）加入10毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 置于－20℃冰箱里避光2周（注意：可以减少淀粉聚集）
5． 用刀片切碎组织
6． 放进一个预冷的50毫升锥形离心管
7． 加入预冷的35毫升HEPENGBIO裂解工作液
8． 使用飞利浦手持式搅拌机处理2分钟
9． 即刻放进预冷的50毫升DOUNCE匀浆器，在冰槽里用匀浆帮匀化组织，直至组织颗粒消失（注意：参见注意事项7）
10． 使用4层纱布或60微米尼龙网，真空过滤
11． 将所有组织过滤液移入50毫升锥形离心管
12． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
13． 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的50毫升锥形离心管
14． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g ——此步骤去除细胞壁、淀粉颗粒、细胞核和未溶解的细胞以及完整质体等残渣
15． 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的50毫升锥形离心管
16． 放进4℃超速离心机离心15分钟，速度为18000g
17． 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
18． 加入500微升HEPENGBIO保存液（ReagentE），充分混匀沉淀颗粒
19． 放进－70℃冰箱里备用或放进冰槽里继续后续操作
20． 移取1.5毫升的HEPENGBIO高纯液A（ReagentF1）到6毫升超速离心管（注意：使用前摇匀HEPENGBIO高纯液A(ReagentF1)）
21． 小心移取1.5毫升的HEPENGBIO高纯液B（ReagentF2）到HEPENGBIO高纯液A（ReagentF1）上面，避免震动（注意：使用前摇匀HEPENGBIO高纯液B(ReagentF2)）
22． 小心移取1.5毫升的HEPENGBIO高纯液C（ReagentF3）到HEPENGBIO高纯液B（ReagentF2）上面，避免震动（注意：使用前摇匀HEPENGBIO高纯液C(ReagentF3)）
23． 轻轻加入500微升上述线粒体混匀液在HEPENGBIO高纯液C（ReagentF3）的上面，避免震动
24． 放进4℃超速离心机离心45分钟，速度为40000g
25． 小心取出超速离心管：可见下端浅绿色或乳黄色样品带
26． 小心抽去线粒体样品带以上的液体
27． 小心收集线粒体样品带到2毫升离心管（用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）
28． 加入1至2毫升HEPENGBIO保存液（ReagentE）
29． 放进4℃超速离心机离心15分钟，速度为18000g
30． 小心抽去上清液
31． 加入500微升HEPENGBIO保存液（ReagentE），混匀
32． 小心移取2.5毫升的HEPENGBIO高纯液A（ReagentF1）到6毫升超速离心管，避免震动（注意：使用前摇匀HEPENGBIO高纯液A(ReagentF1)）
33． 小心移取2毫升的HEPENGBIO高纯液B（ReagentF2）到HEPENGBIO高纯液A（ReagentF1）上面，避免震动（注意：使用前摇匀HEPENGBIO高纯液B(ReagentF2)）
34． 轻轻加入500微升上述线粒体混匀液在HEPENGBIO高纯液B（ReagentF2）的上面，避免震动
35． 放进4℃超速离心机离心45分钟，速度为40000g
36． 小心取出超速离心管：可见下端浅绿色或乳黄色样品带
37． 小心抽去线粒体样品带以上的液体
38． 小心收集线粒体样品带到2毫升离心管（用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）——此步骤获得高纯线粒体样品带
39． 加入1至2毫升HEPENGBIO保存液（ReagentE）
40． 放进4℃超速离心机离心15分钟，速度为18000g
41． 小心抽去上清液
42． 加入100微升HEPENGBIO保存液（ReagentE），混匀
43． 放进－70℃冰箱里保存
二、植物细胞或原生质体线粒体分离
实验开始前，将试剂盒里的HEPENGBIO净化液（Reagent C）和HEPENGBIO活性液（Reagent D）冻融，然后移取140微升HEPENGBIO活性液（Reagent D）、7毫升HEPENGBIO净化液（Reagent C）和28毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到50毫升锥形离心管里，混匀后，标记为HEPENGBIO裂解工作液，置入冰槽里备用。然后进行下列操作。
1． 准备5 X 108植物细胞或原生质体
2． 移入一个50毫升锥形离心管
3． 放进台式离心机离心10分钟，速度为300g
4． 小心抽去上清液
5． 加入10毫升预冷的HEPENGBIO清理液（Reagent A），混匀细胞
6． 放进台式离心机离心10分钟，速度为300g
7． 小心抽去上清液
8． 加入预冷的35毫升HEPENGBIO裂解工作液
9． 涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群
10． 即刻放进预冷的50毫升DOUNCE匀浆器，在冰槽里用匀浆帮匀化细胞，直至细胞颗粒消失（注意：参见注意事项7）
11． 将所有细胞匀浆液移入50毫升锥形离心管，放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
12． 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的50毫升锥形离心管（如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为3000g）——此步骤去除细胞壁、淀粉颗粒、细胞核和未溶解的细胞以及完整质体等残渣
13． 放进4℃超速离心机离心15分钟，速度为18000g
14． 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
15． 加入500微升HEPENGBIO保存液（ReagentE），充分混匀沉淀颗粒
16． 放进－70℃冰箱里备用或放进冰槽里继续后续操作
17． 移取1.5毫升的HEPENGBIO高纯液A（ReagentF1）到6毫升超速离心管（注意：使用前摇匀HEPENGBIO高纯液A(ReagentF1)）
18． 小心移取1.5毫升的HEPENGBIO高纯液B（ReagentF2）到HEPENGBIO高纯液A（ReagentF1）上面，避免震动（注意：使用前摇匀HEPENGBIO高纯液B(ReagentF2)）
19． 小心移取1.5毫升的HEPENGBIO高纯液C（ReagentF3）到HEPENGBIO高纯液B（ReagentF2）上面，避免震动（注意：使用前摇匀HEPENGBIO高纯液C(ReagentF3)）
20． 轻轻加入500微升上述线粒体混匀液在HEPENGBIO高纯液C（ReagentF3）的上面，避免震动
21． 放进4℃超速离心机离心45分钟，速度为40000g
22． 小心取出超速离心管：可见下端浅绿色或乳黄色样品带
23． 小心抽去线粒体样品带以上的液体
24． 小心收集线粒体样品带到2毫升离心管（用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）
25． 加入1至2毫升HEPENGBIO保存液（ReagentE）
26． 放进4℃超速离心机离心15分钟，速度为18000g
27． 小心抽去上清液
28． 加入500微升HEPENGBIO保存液（ReagentE），混匀
29． 小心移取2.5毫升的HEPENGBIO高纯液A（ReagentF1）到6毫升超速离心管，避免震动（注意：使用前摇匀HEPENGBIO高纯液A(ReagentF1)）
30． 小心移取2毫升的HEPENGBIO高纯液B（ReagentF2）到HEPENGBIO高纯液A（ReagentF1）上面，避免震动（注意：使用前摇匀HEPENGBIO高纯液B(ReagentF2)）
31． 轻轻加入500微升上述线粒体混匀液在HEPENGBIO高纯液B（ReagentF2）的上面，避免震动
32． 放进4℃超速离心机离心45分钟，速度为40000g
33． 小心取出超速离心管：可见下端浅绿色或乳黄色样品带
34． 小心抽去线粒体样品带以上的液体
35． 小心收集线粒体样品带到2毫升离心管（用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）——此步骤获得高纯线粒体样品带
36． 加入1至2毫升HEPENGBIO保存液（ReagentE）
37． 放进4℃超速离心机离心15分钟，速度为18000g
38． 小心抽去上清液
39． 加入100微升HEPENGBIO保存液（ReagentE），混匀
40． 放进－70℃冰箱里保存
注意事项
1． 本产品为10次操作（1.5克植物组织或5 X 108细胞）
2． 所有操作均须在4℃或以下状态下进行
3． 操作时，须戴手套
4． 建议无菌操作，避免污染母液，尤其是HEPENGBIO裂解液（Reagent B）、HEPENGBIO保存液（Reagent E）和HEPENGBIO高纯液（ReagentF）
5． 建议使用足够的组织或细胞量
6． 建议植物组织使用组织匀浆器操作；德国的BRAUN细胞匀浆器最为理想
7． 通常匀化至细胞颗粒群/组织块状消失为止，达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数
8． HEPENGBIO裂解液（Reagent B）具有吸附去除酚类物质的作用
9． 建议使用40000g以上离心速度；如果没有条件，则不能低于30000g，离心时间增加为60至90分钟
10． 使用HEPENGBIO高纯液（ReagentF）前，须摇匀后加入；并注意避免污染母液
11． 根据超速离心管的大小调整HEPENGBIO高纯液（ReagentF）的使用量或在样品上面加上石蜡油填满
12． 不同组织，其线粒体含量不同；通常1克植物组织的线粒体含量为5至10微克线粒体蛋白
13． 本产品可以获得95至99％纯度的线粒体
14． 线粒体正常活性测定方法是：CITRATE SYNTHASE活性、氧化磷酸化、细胞色素吸收峰谱等
15． 线粒体内外膜完整测定方法是：CYTOCHROME C OXIDASE活性和荧光JC染色
16． 本公司提供线粒体套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、线粒体溶解等
17． 本公司提供系列植物分析试剂产品
本产品仅供科研使用,请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
