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技术文章
HEPENGBIO植物活性线粒体分离试剂盒产品说明书-技术资料/价格-赫澎上海生物
点击次数：2656 发布时间：2024/7/23 11:34:08
HEPENGBIO植物活性线粒体分离试剂盒产品说明书
主要用途
HEPENGBIO植物活性线粒体分离试剂是一种旨在从植物细胞或组织中分离出完整而纯化的活性线粒体细胞器的技术方法。适合于各种新鲜植物组织，包括叶片（leaf）、谷粒（grain）、种子（seed）、以及培养细胞的活性线粒体的制备。其制备物产量高，活性保证，可以被用于线粒体酶活性、细胞凋亡、信号传递、代谢和蛋白组学等的研究。产品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能稳定，分离产量和纯度。
技术背景
线粒体细胞器的分离是现代细胞生物学研究的最常用的手段之一。从任何组织或细胞分离线粒体的技术方法基本上采用：1，通过机械或化学方法破裂细胞；第二，通过低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞器；第三，通过高速差速离心获得线粒体；甚至，第四，可以通过等密度离心获得纯度更高的线粒体。
产品内容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 100毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 40毫升
HEPENGBIO净化液（Reagent C） 10毫升
HEPENGBIO活性液（Reagent D） 200微升
HEPENGBIO强化液（Reagent E） 5毫升
HEPENGBIO保存液（Reagent F） 100毫升
产品说明书1份
保存方式
保存HEPENGBIO净化液（Reagent C）和HEPENGBIO活性液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里； 6月
用户自备
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
1.5毫升离心管：用于保存线粒体的容器
4℃（微型）台式离心机：用于样品操作
DOUNCE匀浆器：用于裂解组织细胞
实验步骤
一、植物组织线粒体分离（组织匀浆法）
实验开始前，将试剂盒里的HEPENGBIO净化液（Reagent C）和HEPENGBIO活性液（Reagent D）冻融，然后移取20微升HEPENGBIO活性液（Reagent D）、1毫升HEPENGBIO净化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为HEPENGBIO裂解工作液，置入冰槽里备用。然后进行下列操作。
1． 准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定1克组织重量
2． （选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
3． （选择步骤）加入10毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 即刻用刀片切碎组织
5． 放进一个预冷的15毫升锥形离心管
6． 加入预冷的5毫升HEPENGBIO裂解工作液
7． 涡旋震荡5秒，充分混匀
8． 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用匀浆帮匀化组织（约80下）（注意：参见注意事项9）
9． 将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管，放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
10． 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管（如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为3000g）——此步骤去除细胞壁、淀粉颗粒、细胞核和未溶解的细胞以及完整质体等残渣
11． 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
12． 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
13． （选择步骤）加入预冷的3毫升HEPENGBIO保存液（Reagent F）
14． （选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5分钟，速度为10000g
15． （选择步骤）小心抽去上清液
16． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent F），充分混匀
17． 即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里
二、植物组织线粒体分离（化学处理法）
实验开始前，将试剂盒里的HEPENGBIO净化液（Reagent C）和HEPENGBIO活性液（Reagent D）冻融，然后移取20微升HEPENGBIO活性液（Reagent D）、1毫升HEPENGBIO净化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为HEPENGBIO裂解工作液，置入冰槽里备用。然后进行下列操作。
1． 准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定1克组织重量
2． （选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
3． （选择步骤）加入10毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 移入一个液氮冻存管
5． 即刻放进液氮罐过夜
6． 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎组织成粉末（注意：切莫使组织冻融）
7． 放进一个15毫升锥形离心管
8． 加入预冷的5毫升HEPENGBIO裂解工作液
9． 涡旋震荡5秒，充分混匀
10． 在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
11． 加入预冷的500微升HEPENGBIO强化液（Reagent E）
12． 涡旋震荡5秒，充分混匀
13． 在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项10）
14． 加入预冷的5毫升HEPENGBIO保存液（Reagent F），轻轻摇动试管混匀
15． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
16． 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管（如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为3000g）——此步骤去除细胞壁、淀粉颗粒、细胞核和未溶解的细胞以及完整质体等残渣
17． 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
18． 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
19． （选择步骤）加入预冷的3毫升HEPENGBIO保存液（Reagent F）
20． （选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5分钟，速度为10000g
21． （选择步骤）小心抽去上清液
22． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent F），充分混匀
23． 即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里
三、植物细胞或原生质体线粒体分离（细胞匀浆法）
实验开始前，将试剂盒里的HEPENGBIO净化液（Reagent C）和HEPENGBIO活性液（Reagent D）冻融，然后移取20微升HEPENGBIO活性液（Reagent D）、1毫升HEPENGBIO净化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为HEPENGBIO裂解工作液，置入冰槽里备用。然后进行下列操作。
1． 准备5 X 107植物细胞或原生质体
2． 移入一个50毫升锥形离心管
3． 放进台式离心机离心10分钟，速度为200g
4． 小心抽去上清液
5． 加入10毫升预冷的HEPENGBIO清理液（Reagent A），混匀细胞
6． 放进台式离心机离心10分钟，速度为300g
7． 小心抽去上清液
8． 加入预冷的5毫升HEPENGBIO裂解工作液
9． 涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群
10． 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用匀浆帮匀化细胞（约80下）（注意：参见注意事项9）
11． 将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管，放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
12． 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管（如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为3000g）——此步骤去除细胞壁、淀粉颗粒、细胞核和未溶解的细胞以及完整质体等残渣
13． 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
14． 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
15． （选择步骤）加入预冷的3毫升HEPENGBIO保存液（Reagent F）
16． （选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5分钟，速度为10000g
17． （选择步骤）小心抽去上清液
18． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent F），充分混匀
19． 即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里
四、植物细胞或原生质体线粒体分离（化学处理法）
实验开始前，将试剂盒里的HEPENGBIO净化液（Reagent C）和HEPENGBIO活性液（Reagent D）冻融，然后移取20微升HEPENGBIO活性液（Reagent D）、1毫升HEPENGBIO净化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为HEPENGBIO裂解工作液，置入冰槽里备用。然后进行下列操作。
1． 准备5 X 107植物细胞或原生质体
2． 移入一个50毫升锥形离心管
3． 放进台式离心机离心10分钟，速度为200g
4． 小心抽去上清液
5． 加入10毫升预冷的HEPENGBIO清理液（Reagent A），混匀细胞
6． 放进台式离心机离心10分钟，速度为300g
7． 小心抽去上清液
8． 加入预冷的5毫升HEPENGBIO裂解工作液
9． 涡旋震荡5秒，充分混匀
10． （选择步骤）200瓦超声仪猝击处理10秒二次，间隙30秒
11． 在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
12． 加入预冷的500微升HEPENGBIO强化液（Reagent E）
13． 涡旋震荡5秒，充分混匀
14． 在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项10）
15． 加入预冷的5毫升HEPENGBIO保存液（Reagent F），轻轻摇动试管混匀
16． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
17． 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管（如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为3000g）——此步骤去除细胞壁、淀粉颗粒、细胞核和未溶解的细胞以及完整质体等残渣
18． 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
19． 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
20． （选择步骤）加入预冷的3毫升HEPENGBIO保存液（Reagent F）
21． （选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5分钟，速度为10000g
22． （选择步骤）小心抽去上清液
23． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent F），充分混匀
24． 即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里
注意事项
1． 本产品为10次操作（1克植物组织或5 X 107细胞）
2． 实际操作的植物组织重量或细胞量与试剂使用量按比例调整：例如200毫克植物组织：试剂用量是标准用量的五分之一
3． 所有操作均须在4℃或以下状态下进行
4． 操作时，须戴手套
5． 建议无菌操作，避免污染母液，尤其是HEPENGBIO裂解液（Reagent B）和HEPENGBIO保存液（Reagent E）
6． 建议使用足够的组织或细胞量
7． 建议植物组织使用组织匀浆器操作；德国的BRAUN细胞匀浆器最为理想
8． 建议严格控制操作时间
9． 通常匀化次数为80下（或细胞颗粒群/组织块状消失为止）达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数
10． 通常孵育5分钟达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升裂解物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加孵育时间和涡旋震荡次数
11． HEPENGBIO裂解液（Reagent B）具有吸附去除酚类物质的作用
12． 不同组织，其线粒体含量不同；通常1克植物组织的线粒体含量为10至50微克线粒体蛋白
13． 如果需要计量线粒体，稀释后数分钟内完成，否则线粒体将分解
14． 本产品所获得的线粒体纯度和产量最为理想。通过调整10000g离心速度到3000至8000g，可以提高粗提的线粒体纯化程度，但线粒体产量相应减少
15． 如果需要获得99％以上纯度的线粒体，使用HEPENGBIO植物高质纯化线粒体分离试剂盒
16． 线粒体正常活性测定方法是：CITRATE SYNTHASE活性、氧化磷酸化、细胞色素吸收峰谱等
17． 线粒体内外膜完整测定方法是：CYTOCHROME C OXIDASE活性和荧光JC染色
18． 本公司提供线粒体套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、线粒体溶解等
19． 本公司提供系列植物分析试剂产品
本产品仅供科研使用,请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
