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技术文章
革兰氏阴性细菌外膜囊泡高纯制备试剂盒@技术背景
点击次数：2651 发布时间：2024/7/22 11:56:13
HEPENGBIO革兰氏阴性细菌外膜囊泡高纯制备试剂盒
产品说明书
主要用途
HEPENGBIO革兰氏阴性细菌外膜囊泡高纯制备试剂是一种旨在使用差速和等密度离心，高度分离并收集所有细胞外膜囊泡的方法。其制备物产量高，活性保证，纯度可达99％。适合于各种革兰氏阴性细菌外膜囊泡及其蛋白的高质纯化。产品即到即用，性能稳定，操作便捷，萃取产量和纯度皆佳。
技术背景
外膜囊泡（outer membrane vesicle；OMV）为含有周质内容物（包括外膜蛋白、DNA、RNA、脂多糖、脂质、周质蛋白、黏附素、免疫调节化合物等）的球形电子致密芽状体（spherical bud），细胞外间隔体，双层磷脂，20至200纳米大小，来自于革兰氏阴性细菌周边突起物的释放形成或胞外分泌产物，使之与环境或宿主细胞进行反应，并调解各种功能，包括促进病理形成，调节细菌互动，转运各种信号分子（例如DNA、RNA、蛋白质、内毒素、毒力因子等），保护细菌生存、结合和侵入，引起毒性，产生抗生素抗性等。外膜囊泡的产量取决于细菌生长周期、营养条件、温度、氧化应激状态等。病原菌的外膜囊泡10倍于非病原菌体。外膜囊泡具有疫苗开发中免疫调节潜力。通过差速离心和等密度离心，获得高纯外膜囊泡，充分保留其蛋白质的免疫和生物学活性。
产品内容
HEPENGBIO保存液（Reagent A） 250毫升
HEPENGBIO高纯液A（ReagentB1） 80毫升
HEPENGBIO高纯液B（ReagentB2） 80毫升
HEPENGBIO溶解液（Reagent C） 10毫升
HEPENGBIO活性液（Reagent D） 50微升
产品说明书 1份
保存方式
保存HEPENGBIO活性液（ReagentD）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，6月
用户自备
250毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
1.5毫升离心管：用于样品保存的容器
分光光度仪：用于测定细菌浓度
台式离心机：用于样品操作
超速离心机：用于样品操作
恒温摇床：用于培养细菌细胞
0.45微米滤膜：用于样品操作
真空浓缩装置：用于样品操作
实验步骤
实验开始前，将试剂盒里的HEPENGBIO活性液（ReagentD）从－20℃的冰箱里取出，置入冰槽里冻融，然后移出1毫升HEPENGBIO溶解液（ReagentC）到1.5毫升离心管，加入5微升HEPENGBIO活性液（ReagentD），充分混匀，置于冰槽里，标记为HEPENGBIO溶解工作液。然后进行下列操作。
1． 准备好5毫升过夜培养的新鲜细菌样品
2． 移取2.5毫升到500毫升细菌培养液（注意：用户可以进行诱导培养，例如无铁培养等）
3． 放进37℃恒温摇床孵育过夜，速度为200RPM
4． 在分光光度仪上测OD600为1（1 OD＝1 X 109细胞/毫升）
5． 转移到预冷的250毫升锥形离心管（注意：用户可以根据实际情况，使用适宜的离心管）
6． 放进4℃台式离心机离心30分钟，速度为5000g
7． 小心移取上清液到新的500毫升容器
8． 重复实验步骤6和7一次
9． 使用0.45微米滤膜真空过滤一次
10． （选择步骤）使用100kD蛋白临界点浓缩处理（例如Millipore centriplus YM100）
11． 放进4℃超速离心机离心3小时，速度为150000g
12． 小心抽去上清液
13． 加入2毫升预冷的HEPENGBIO保存液（Reagent A），充分混匀沉淀颗粒
14． 放进－70℃冰箱里备用或放进冰槽里继续后续操作
15． 移取4毫升HEPENGBIO高纯液A（ReagentB1）到10毫升超速离心管 （注意：用户根据离心机情况，调整试剂用量）
16． 沿着管壁轻轻加入4毫升HEPENGBIO高纯液B（ReagentB2）在HEPENGBIO高纯液A（ReagentB1）的上面，避免震动
17． 沿着管壁轻轻加入2毫升囊泡混匀液在HEPENGBIO高纯液B（ReagentB2）的上面，避免震动
18． 放进4℃超速离心机离心20小时，速度为200000g
19． 小心取出超速离心管：可见下端（HEPENGBIO高纯液A（ReagentB1）和HEPENGBIO高纯液B（ReagentB2）交界处附近）白色样品带
20． 小心抽去囊泡样品带以上的液体
21． 小心收集囊泡样品带到10毫升超速离心管（注意：用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）——此步骤获得高纯外膜囊泡样品
22． 加入适量HEPENGBIO保存液（ReagentA）至管顶
23． 放进4℃超速离心机离心3小时，速度为150000g
24． 小心抽去上清液
25． 加入500微升HEPENGBIO保存液（ReagentA），混匀
26． 即刻移入到预冷的1.5毫升离心管
27． 放进－70℃冰箱里保存
28． 或加入200微升预冷的含有HEPENGBIO溶解液（ReagentC）和HEPENGBIO活性液（ReagentD）的HEPENGBIO溶解工作液
29． 用枪头上下抽吸，充分混匀
30． 转移到新的预冷的1.5毫升离心管
31． 即刻放进－70℃冰箱里保存或置于冰槽里备用
32． 进行后续蛋白定量、荧光定量或电镜检测等
33．
注意事项
1． 本产品为20次（500毫升菌液）操作
2． 所有操作须在4℃状态下进行
3． 建议使用新鲜细菌接种，培养到指数生长阶段为理想状态
4． 使用HEPENGBIO高纯液（ReagentB），严格注意避免污染母液
5． HEPENGBIO活性液（ReagentD）避免反复冻融
6． 本产品按照500毫升培养菌液配制。如果操作不同菌液容量，可相应调整试剂用量
7． 根据菌种不同，500毫升（OD600＝1）菌液可获得5至50微克高纯外膜囊泡蛋白
8． 制备产物如果放在－70℃冰箱里储存备用，严格避免反复冻融
本产品仅供科研使用,请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
