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技术文章
通用型细菌16S rDNA 荧光定量PCR扩增检测试剂盒使用方法你知道吗？
点击次数：2690 发布时间：2024/7/22 11:49:14
HEPENGBIO通用型细菌16S rDNA荧光定量PCR扩增检测试剂盒产品说明书
主要用途
HEPENGBIO通用型细菌16S rDNA荧光定量PCR扩增检测试剂是一种旨在运用SYBR绿色荧光染料作为标记信号，针对微生物样本DNA进行保守性序列PCR扩增，实时检测和定量分析扩增产物的技术方法。可以被用于各种样品，包括血液、体液、组织、土壤等的细菌拷贝数的定量检测。产品即到即用，性能稳定，无核酶污染，操作便捷，敏感高效，定量准确，重复性强。
技术背景
16SrRNA作为非培养依赖性标记的分子指模（fingerprinting）技术，有别于传统的选择性培养技术，用于研究微生物的分类学（phylogenetics）。核糖体RNA（ribosome RNA）存在于所有微生物体内，且结构与功能进化保留；容易分离和识别；其一级和二级结构具有高度进化保守区域（conserved region）和物种特异性可变区域（variable region）；其基因序列变异非常缓慢，且不会发生平行基因转移（horizontal gene transfer）。其包括5S、16S、23S。5S信息量不够充分；23S不稳定；而微生物16SrRNA基因较为稳定，初级结构含有1500个碱基。通过引物设计，扩增产物。SYBR绿色荧光染料，作为DNA结合染料，可以和扩增子（amplican）上双链DNA的任一小沟（minor groove）结合，而发出荧光信号。根据每一循环的荧光强度来确定扩增产物的产量，并用循环阈值（threshold cycle；Ct）表示，计算获得拷贝数。
产品内容
HEPENGBIO反应液（Reagent A） 300微升
HEPENGBIO染色液（Reagent B） 40微升
HEPENGBIO引物液（Reagent C） 40微升
HEPENGBIO补充液（Reagent D） 500微升
HEPENGBIO封隔液（Reagent E） 1.5毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里；HEPENGBIO染色液（Reagent B）避免光照；6月
用户自备
15毫升锥形离心管：用于样品预处理的容器
1.5毫升离心管：用于预处理的容器
（微型）台式离心机：用于样品处理
PCR管：用于样品扩增操作的容器
荧光定量PCR仪：用于荧光定量PCR反应
实验步骤
实验开始前，从－20℃冰箱中取出试剂，放进冰槽里融化。然后进行下列操作：
1． 一次反应总量为25微升
2． 移取15微升HEPENGBIO反应液（Reagent A）到0.5毫升PCR管
3． 加入5微升待测的DNA模板（或20纳克）
4． 加入2微升HEPENGBIO染色液（Reagent B）
5． 加入2微升HEPENGBIO引物液（Reagent C）
6． 加入1微升HEPENGBIO补充液（ReagentD）至总容量为25微升
7． 放进4℃微型台式离心机瞬时离心5秒
8． 使用1000微升枪头加入1滴HEPENGBIO封隔液（ReagentE）（注意：参见注意事项10）
9． 即刻放进荧光定量PCR仪
10． 荧光定量PCR反应程序为：
温度（℃） | 时间 | 循环 |
95 | 15分钟 | 1 |
95 50 72 | 15秒 20秒 30秒 |
40 |
72 | 5分钟 | 1 |
11． 进行数据分析
（1） 采用比较阈值分析法（ΔΔCt），即相对定量，计算样品拷贝数：建议使用用户自备的对照样品或大肠杆菌细菌株
（2） 或采用标准曲线法，即绝对定量，计算样品拷贝数
（3） 细菌量单位计算：拷贝数/毫升样品（copies/ml）或拷贝数/微克样品DNA（copies/µg）
A） 根据上述方法获得待测样品拷贝数（Q）
B） 根据下列公式计算单位拷贝数，即拷贝数/毫升样品（copies/ml）或拷贝数/微克样品DNA（copies/µg）
C：单位拷贝数
Q：待测样品拷贝数
VDNA：DNA萃取后的总容量
VPCR：反应体系中DNA模板容量（5微升）
VEXT：原始样品总容量
注意事项
1． 本产品为20次PCR反应
2． 操作时，须戴手套
3． 样品操作注意生物安全
4． 本产品适合各种荧光定量PCR仪
5． 建议整个操作在4℃下进行
6． 建议使用带滤芯的枪头，避免交叉污染
7． 使用时，避免污染母液
8． 样品DNA的纯度将影响定量扩增的效率（注意：建议使用HEPENGBIO细菌基因组DNA纯化试剂盒）
9． 建议使用HEPENGBIO补充液（Reagent D）作为阴性对照
10． 根据用户PCR仪的性能，决定是否加入HEPENGBIO封隔液（ReagentE）
11． 配制完成后，即刻进行扩增反应，以确保反应物的活性
12． 试剂避免反复冻融
13． PCR扩增反应的最初3个循环为定量基线；3至15个循环的荧光信号的10倍值为荧光阈值；荧光信号达到阈值所需的循环数为Ct值（参考图像如下）
14． 用户可以通过自备的对照样品确定待测样品的细菌拷贝数
15． 本公司提供系列细菌16S rDNA扩增检测试剂产品
本产品仅供科研使用,请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
