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技术文章
甘露糖 (D-Mannose) 含量检测试剂盒说明书 (分光法 48 样)注意事项有哪些？
点击次数：2699 发布时间：2024/7/19 10:26:39
甘露糖(D-Mannose) 含量检测试剂盒说明书
(分光法48样)
一、产品简介：
本试剂盒提供一种定量、快速、简单、灵敏的检测甘露糖含量的方法，甘露糖经特异 性酶作用后转化为葡萄糖，葡萄糖在己糖激酶等酶复合物作用下，使NADPH的量不断增 加，通过检测340nm下该物质的增加量，进而计算得到甘露糖含量。
二、试剂盒组分与配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 粉剂×1支 | -20℃保存 | 临用前甩几下或离心，使粉剂落入 底部，再加1. 1mL蒸馏水备用。 |
试剂二 | 液体1mL×1支 | 4℃保存 |
|
试剂三 | 液体30mL×1瓶 | 4℃保存 |
|
试剂四 | 粉剂×1支 | -20℃保存 | 临用前甩几下或离心，使粉剂落入 底部，再加1. 1mL蒸馏水备用，可分 装后-20℃保存。 |
试剂五 | 液体μL×1支 | -20℃保存 | 临用前甩几下或离心，使微量液体 落入底部，再加1. 1mL蒸馏水备用， 可分装后-20℃保存。 |
试剂六 | 液体μL×1支 | -20℃保存 | 临用前甩几下或离心，使微量液体 落入底部，再加1. 1mL蒸馏水备用， 可分装后-20℃保存。 |
三、所需仪器和用品：
紫外分光光度计、1mL 的石英比色皿(光径1cm) 、天平、可调式移液器、研钵、离 心机、蒸馏水。
四、甘露糖含量检测：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：
取0.1g 组织样本(水分充足样本建议取0.2g 左右) 至EP 管中，加1mL 的蒸馏水或 生理盐水研磨，粗提液全部转移到EP 管中，12000rpm ，常温离心10min，上清液待测。
【注】：做实验前可以选取几个样本，找出适合本次检测样本的稀释倍数D ，果实样本含糖量较高， 可稀释20-40倍；叶片样本可稀释2-5倍。
② 液体样品：
近似中性的澄清液体样本可直接检测；若为酸性样本则需先用NaOH(2M)调PH 值约 7.4，然后室温静置30min ，取澄清液体直接检测。
【注】可选取几个样本，进行不同倍数的稀释，选取适合本次样本的稀释倍数D。
③ 细菌/细胞样本：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞加入1mL 蒸 馏水或生理盐水，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率200W ，超声3s ，间隔10s，重复30次)；12000rpm 室温离心10min，取上清，上清液待测。
【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量(104)：提取液(mL)为500~ 1000：1的比例进行提取。
2、上机检测：
1 紫外分光光度计预热30min ，设置温度在25℃，设定波长到340nm，蒸馏水调零。
2 所有试剂解冻至室温(25℃) ，或于25℃水浴锅中孵育15min ；在1mL 的石英比色 皿(光径1cm) 中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 空白管(仅做一次) |
样本 | 60 |
|
蒸馏水 |
| 60 |
试剂一 | 20 | 20 |
试剂二 | 20 | 20 |
试剂三 | 560 | 560 |
试剂四 | 20 | 20 |
试剂五 | 20 | 20 |
混匀，室温(25℃) 反应20min于340nm处读取各管的A1 值(若A值继续增加，可延长反应时间，直至2分钟内的吸 光值保持不变即2分钟内吸光值变化不超过0.05) 。 | ||
试剂六 | 20 | 20 |
混匀，室温(25℃) 反应30min于340nm处读取各管的A2 值(若A值继续增加，需延长反应时间，直至2分钟内的吸 光值保持不变即2分钟内吸光值变化不超过0.05) ， ΔA=(A2-A1)测定-(A2-A1)空白。 | ||
【注】1.试剂一和二和三和四和五可按照比例20:20:560:20:20可预先混合(检测多少个样本预先 混合多少样本的试剂量，现配现用) ，混合后直接加640μL混合液即可。检测反应20min后是否反应完全，在准备读值时可改用时间扫描：3min ，间隔1min ，依此判读反应是 否完全。然后再读取各测定管的A值。
2.若A2值超过1.5，可以减少样本加样量V1 (如减至20μL) ，则试剂三相应增加；或对样 本用蒸馏水进行稀释，稀释倍数D和改变后的V1需代入计算公式计算。
3.若ΔA的差值在零附近即ΔA小于0.01，可增加样本加样量V1 (如增至120μL) ，则试剂 三相应减少，改变后的V1需代入计算公式计算。
五、结果计算：
1、按照质量计算：
甘露糖含量(mg/g 鲜重)=[ΔA÷(ε×d) ×V2×Mr×103]÷(W×V1÷V) ×D=0.343×ΔA÷W×D2、按照体积计算：
甘露糖含量(mg/mL)=[ΔA÷(ε×d) ×V2×Mr×103]÷V1×D=0.343×ΔA×D
3 、按细胞数量计算：
甘露糖含量(μg/ 104cell)=[ΔA÷(ε×d)×V2×Mr×106]÷(500×V1÷V) ×D=343×ΔA÷500×D
ε---NADPH 的摩尔消光系数，6.3×103L/mol/cm； V---加入提取液体积，1mL； V2---反应总体积，7.2×10-4L；
500---细胞数量，万；
D---稀释倍数，未稀释即为1。
d---光径，1cm； V1---加入样本体积，0.06mL； Mr---甘露糖分子量，180. 16；
W---样本鲜重，g；
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
