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技术文章
植物种子甲磺酸乙脂突变诱导试剂盒说明书@技术背景
点击次数：2693 发布时间：2024/7/19 10:23:53
植物种子甲磺酸乙脂突变诱导试剂盒产品说明书
主要用途
HEPENGBIO 植物种子甲磺酸乙脂突变诱导试剂是一种旨在使用烷化剂甲磺酸乙酯饱和性诱导植物种子细 胞发生变异而产生基因功能缺失或获得的种子突变株，成为筛选种子遗传标记和应用分子育种的方法。其适用于各种植物种子包括土豆、大豆、水稻等 农作物的诱导突变。产品严格无菌，即到即用，性能稳定，突变频率高。
技术背景
诱导突变(mutagenesis )，包括物理 (放射性)、化学、插入方法等，作为一种手段，用来确定和分析 生物体的基因功能，即通过基因突变所产生的表型变异和生理反应。甲磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate； methanesulfonic acid ethyl ether；ethylmesylate ；EMS) 是一种化学诱变致畸的烷化剂 (alkylating agent) 。 通过导致错配和碱基变异，即C/G 替换成T/A ，产生同一基因上或基因组上随机多样性突变位点，以此发 现基因的功能缺失或功能获得，以及特定氨基酸在蛋白质中的功能所在(正向筛选) 。同时进一步分析其 单核苷酸多态性与基因功能的关系(逆向筛选) ，从而了解植物发育和代谢的生物学机制。
产品内容
HEPENGBIO 湿润液(Reagent A)
HEPENGBIO 诱导液(Reagent B)
HEPENGBIO 处理液(Reagent C)
HEPENGBIO 中和液(Reagent D)
产品说明书
保存方式
3 X 500毫升
60毫升
3毫升
900毫升
1份
保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO 诱导液(Reagent B) 和HEPENGBIO 处理液(Reagent C) 具有毒性，注 意操作安全；6月
用户自备
无离子水：用于清洗
250毫升三角烧瓶：用于植物种子突变诱导的容器
平式摇荡仪：用于混匀反应
PARAFILM：用于密封反应容器
通风柜：用于安全操作的设施
花盆或农田：用于种子播种和生长
暖房：用于植物生长的环境
实验步骤
一、 诱导准备
1 ． 准备好4个15毫升锥形离心管，标记为1至4号管
2． 分别加入4.5至5毫升HEPENGBIO 诱导液 (Reagent B) 到每个离心管
3． 小心移取125微升HEPENGBIO 处理液 (Reagent C) 到2号管，混匀
4． 小心移取250微升HEPENGBIO 处理液 (Reagent C) 到3号管，混匀
5． 小心移取500微升HEPENGBIO 处理液 (Reagent C) 到4号管，混匀
6． 将1至4号管放进冰槽里备用，避免光照 (注意：诱导工作液配制后，不宜过夜保存后使用)
管号 | HEPENGBIO 诱导液 (Reagent B) | HEPENGBIO 处理液 (Reagent C) | 备注 |
1 | 5 毫升 | 0 | 对照 |
2 | 4.875毫升 | 125微升 | 0.25% |
3 | 4.75毫升 | 250微升 | 0.5% |
4 | 4.5毫升 | 500微升 | 1% |
二、诱导反应
1 ． 准备好已知数量的(例如2克或100至5000颗不等) 等待诱变的干种子 (例如土豆、大豆、水稻等种 子)(注意：用户根据实验目的，可以增加或减少种子数量)
2． 放进4个250毫升三角烧瓶，标记为1至4号 (其中1号为对照组)
3． 分别加入50毫升HEPENGBIO 湿润液 (Reagent A)
4． 放在平式摇荡仪上，在4℃条件下孵育16至20小时，速度为30至120RPM (注意：确保种子移动)
5 ． 室温下，静置5分钟
6． 分别小心移去上清液――此为M0种子
7． 移入到通风柜里
8． 分别加入45毫升HEPENGBIO 湿润液 (Reagent A)
9． 分别加入上述配制的5毫升HEPENGBIO 诱导工作液到相对应的三角烧瓶1至4号
10．用PARAFILM 封住瓶口
11．放在平式摇荡仪上，室温下孵育8小时，速度为30至120RPM (注意：确保种子移动)
12．分别小心移去上清液
13．分别小心加入50毫升HEPENGBIO 中和液 (Reagent D) 到三角烧瓶2至4号
14．放在平式摇荡仪上，室温下孵育20分钟，速度为30至120RPM (注意：确保种子移动)
15．分别小心移去上清液
16．重复实验步骤13至15一次
17．分别小心加入50毫升用户自备的无离子水到三角烧瓶1至4号
18．放在平式摇荡仪上，室温下孵育20分钟，速度为30至120RPM (注意：确保种子移动)
19．分别小心移去上清液
20．重复实验步骤17至19二次
21．分别将处理好的种子放在绵纸上16小时，使其吸干――此为M1种子
三、 播种
1． 准备好适量的(根据种子量，约1个种子/cm2)8cm X 8cm 大小的湿润土壤花盆
2． 用镊子将 60个M1种子均匀一致地置于1个土壤花盆中(注意：1号对照组的M1种子须与2、3、4号种子分开)
3． 放进4℃培养箱里孵育2天
4． 转移到25℃培养箱里继续孵育，日光照时间为16小时(即16小时光照，8小时暗室) 或置于暖房里， 接受日光规律
5． 直至数周种子长叶开花(通常5至8周时间)――此为M1植物
6． 观察植物性状，评价突变情况：
1) 白化症(albinism)：观察叶绿体的色彩变化 (淡绿色、黄色、 白色、混合色等)
2) 胚胎致死率 (embryo lethality)
3) 表皮毛状体 (trichome)
7 ． 用小药勺分离来自于M1植物(尤其突变株) 的种子，并清点——M2种子 方法一：单一家系搜集――即每个M1植物独立搜集计数
方法二：集合搜集――即所有M1植物放在一起计数
8． 客户可以继续M2植物、M3种子等的操作
9． 分析：
1) 对照组存活率(％) ＝ (M1植物数÷M1种子数)X 100％
2) 诱导处理存活率(％) ＝ (M1植物数÷M1种子数)X 100％
3) 诱导处理致死值＝诱导处理存活率(％)÷对照组存活率(％)
4) M1植物生育率(％) ＝ (M2种子家系÷M1植物数)X 100％
5) 叶绿体总突变率(％) ＝ (非绿色M1植物数÷总存活M1植物数)X 100％
6) 发芽率 (％) ＝ (发芽特征M1种子数÷M1种子数)X 100％
7) M2、M3分析参照上述方法
注意事项
1 ． 本产品为3次操作规格
2． 操作时，须戴手套；严格注意操作安全
3． 操作时，须在通风柜里操作
4． 甲磺酸乙酯为有毒挥发性致畸剂，因此所有接触过的器皿和用品都要使用0. 1M 硫代硫酸钠(Sodium Thiosulfate ；Na2S2O3) 冲洗或中和。溶液里须加入浓度为0. 1M 硫代硫酸钠，在室温下孵育至少
10分钟，然后废弃处理掉；建议使用HEPENGBIO- 1.0M 硫代硫酸钠溶液
5． 用户根据种子数量和大小，调整试剂用量
6． 如果 M0种子在培养皿上培养，建议使用6％次氯酸钠溶液清洗M0种子5分 钟，然后用无菌无离子水清洗4次
7 ． 操作时，新鲜配制的HEPENGBIO 诱导工作液按顺序与1号至4号样品标记对应；其中1号 HEPENGBIO 诱导工作液即三角烧瓶1号为对照组
8． 新鲜配制的诱导工作液，不得过夜保存后使用
9． EMS 诱导浓度超过1％，将降低突变频率
10．建议获得高频率突变的同时，发芽率须大于50％
11．如果没有发现突变株，建议(1) 增加HEPENGBIO 诱导工作液液的孵育时间，最长可达48小时；(2) 增加种子数，最多可达120000
12．如果意欲建立诱导突变库，建议使用10000个M0种子
13．根据不同植物的表型，突变观察指征，包括种子(发芽、种苗死亡)、植物大小、植物习性 (节间长度、 分枝、中止生长等)、叶片形态、叶片色泽、开花时间、花序结构、花朵形态、花朵色泽、果子大小、 果子形态、果子色泽、果子成熟时间、生育状况、以及疾病和应急反应等
14．通常M2的突变频率为5%
15．部分植物种子推荐诱导浓度
植物种子 | EMS 浓度 (％) | 诱导时间 (小时) | 突变效率 (％) |
稻米 (rice) | 0.5 | 6- 16 | 6 |
大豆 (soybean ) | 0.5 | 6-8 | 9 |
玉米 (maize) | 0.2 | 6- 16 | 5 |
高梁 (sorghum ) | 0.25 | 6- 16 | 6 |
甜菜 (sugarbeet) | 1 | 6- 16 | 8 |
小麦 (wheat) | 0.4 | 6- 16 | 6 |
大麦 (barley) | 0.3 | 6- 16 | 5 |
西红柿 (tomato ) | 0.5 | 6- 16 | 8 |
16．本公司提供系列甲磺酸乙脂诱导突变试剂产品
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
