企业档案
会员类型：标准版
已获得阿仪网信誉 等级评定
(0 -40)基础信誉积累，可浏览访问
(41-90)良好信誉积累，可接洽商谈
(91+ )优质信誉积累，可持续信赖
阿仪网标准版会员：11年
工商认证 【已认证】
最后认证时间：
注册号： 【已认证】
法人代表： 【已认证】
参观次数：4594575
技术文章
细菌呼吸链复合物I活性光度法定量检测试剂盒产品说明书
点击次数：2682 发布时间：2024/7/18 15:16:45
HEPENGBIO细菌呼吸链复合物I活性光度法定量检测试剂盒产品说明书
主要用途
HEPENGBIO细菌呼吸链复合物I（NADH－辅酶Q还原酶）活性光度法定量检测试剂是一种旨在使用醌同功类似物和特异性抑制剂，通过反应系统测定样品中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后峰值的降低，即采用光度法测定样品中酶活性的方法。其适合于各种野生、培养或病原性细菌膜蛋白悬液样品的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）－Q还原酶的特异性活性检测。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。
技术背景
细菌呼吸链复合物I，又称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化还原酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide quinone oxidoreductase；NADH-Q oxidoreductase；EC1.6.99.3），或称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶1（reduced nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase-1；NADH dehydrogenase-1；NAD1），是质子转移酶，有别于NAD2和Na-NDH。呼吸链复合物I需要辅因子FMN，含有铁硫簇，14个亚体，530kD分子量，位于细胞膜上。其特征性的酶活性是鱼藤酮敏感，催化电子通过FMN和铁硫簇由电子供体NADH转递到受体醌上的能量转移反应，为整个呼吸链反应系统的一步。基于醌底物，在鱼藤酮存在与否的情况下，通过NADH－Q还原酶的催化，转化成还原型醌（QH2），同时还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized
nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），在分光光度仪下产生吸收峰值的变化（340nm波长），由此定量测定NADH－Q还原酶的特异活性。其反应系统是：
NADH:Q Reductase
NADH + H＋ + Q → NAD－ + QH2
产品内容
HEPENGBIO缓冲液（Reagent A） 20毫升
HEPENGBIO反应液（Reagent B） 2.5毫升
HEPENGBIO阴性液（Reagent C） 2毫升
HEPENGBIO底物液（Reagent D） 500微升
HEPENGBIO专性液（Reagent E） 200微升
产品说明书 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；HEPENGBIO反应液（Reagent B）含有毒性物质，避免直接用手接触；HEPENGBIO反应液（Reagent B）和HEPENGBIO底物液（Reagent D），避免光照，6月
用户自备
比色皿：用于光度分析的容器
分光光度仪：用于光度分析
培养箱：用于孵育反应物
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；HEPENGBIO缓冲液（Reagent A）室温预热；HEPENGBIO反应液（Reagent B）和HEPENGBIO底物液（Reagent D）注意避光。然后进行下列操作。
一、 测定准备
1． 准备好待测样品（例如细菌膜蛋白样品等），置于冰槽里
2． 设定好双波长分光光度仪（温度为30℃）：波长分别为340nm，间隔30秒，读数7次（共3分钟），并置零
二、 背景对照测定
1． 移取780微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2． 加入100微升HEPENGBIO反应液（Reagent B）
3． 加入20微升HEPENGBIO底物液（Reagent D）
4． 放进30℃培养箱里静置3分钟
5． 加入100微升HEPENGBIO阴性液（Reagent C）
6． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
7． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟－340波长读数1分钟或3分钟
三、 样品总活性测定
1． 移取780微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2． 加入100微升HEPENGBIO反应液（Reagent B）
3． 加入20微升HEPENGBIO底物液（Reagent D）
4． 放进30℃培养箱里静置3分钟
5． 加入100微升待测样品（注意：50微克细菌膜蛋白）
6． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
7． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟－340波长读数1分钟或3分钟
四、 样品非特异活性测定
1． 移取760微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2． 加入100微升HEPENGBIO反应液（Reagent B）
3． 加入20微升HEPENGBIO专性液（Reagent E）
4． 加入20微升HEPENGBIO底物液（Reagent D）
5． 放进30℃培养箱里静置3分钟
6． 加入100微升待测样品（注意：50微克细菌膜蛋白）
7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：340波长读数0分钟－340波长读数1分钟或3分钟
五、 计算样品活性
1）样品活性（总活性或非特异活性）
【（样品读数－背景读数）X 1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数】÷【0.1（样品容量；毫升）X6.22（毫摩尔吸光系数） X 1或3（反应时间；分钟）】＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔NADH/分钟
2）样品特异活性
样品总活性－样品非特异活性＝样品特异活性
注意事项
1． 本产品为21次（10个样本）操作，包括背景对照测定
2． 操作时，须戴手套
3． 系统操作过程中，背景测定只需1次
4． 如果增强酶活检测，建议使用细菌膜蛋白样品。推荐HEPENGBIO细菌呼吸链复合物检测样品制备试剂盒
5． 加入样品启动反应后3秒内即刻光度测定
6． 如果样本存在明显干扰，可以选择进行样本背景对照测定，即不加HEPENGBIO反应液（Reagent B），加入待测样品替代HEPENGBIO阴性液（Reagent C）
7． 通常反应1分钟后光度测定值趋于稳定；测定值由高到低变化；测定可以持续3分钟
8． 测定值由高到低变化，即3分钟测定读数低于0分钟测定读数，表明有酶活性
9． 光度测定后，比色皿须清洗底
10． 96孔板测定初始读数（0分钟读数）0.5左右为理想状态；比色皿测定为1.0左右
11． 建议待测样本蛋白浓度为50微克/100微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；注意计算公式的调整（本公司提供HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒）
12． 样品特异活性是指鱼藤酮敏感的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸－辅酶Q还原酶，去除其它干扰因素（例如复合物II/III/IV等）
13． 如果用户需要研究呼吸链复合物I总活性包括鱼藤酮敏感和抗性之和，请咨询技术顾问，另购HEPENGBIO补充反应液（Reagent B+）
14． 呼吸链复合物I（NADH－辅酶Q还原酶）单位活性定义为：在30℃，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
15． 本公司提供系列细菌酶类技术产品
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
