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技术文章
动物血小板高质纯化线粒体分离试剂盒实验几个优点你知道吗？
点击次数：2728 发布时间：2024/7/18 15:15:53
HEPENGBIO动物血小板高质纯化线粒体分离试剂盒产品说明书
主要用途
HEPENGBIO动物血小板高质纯化线粒体分离试剂是一种旨在通过低速差速离心和化学渗压休克处理来纯化血小板、以及物理或化学破膜和等密度离心的方法，直接从动物血细胞中分离出活性完整而高度纯化的血小板线粒体细胞器的方法。适合于人体和各种动物全血（鼠、猪、羊等）中血小板活性线粒体的制备。其制备物产量高，活性保证，纯度可达99％。可以被用于线粒体酶活性、细胞凋亡、衰老、信号传递、能量代谢、蛋白组学和古生物学、病理生理学（神经病变或肿瘤）等的研究。产品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能稳定。
技术背景
线粒体细胞器的分离是现代细胞生物学研究的最常用的手段之一。从任何组织或细胞分离线粒体的技术方法基本上采用：一，通过机械或化学方法破裂细胞；第二，通过低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞器；第三，通过高速差速离心获得线粒体；甚至，第四，可以通过等密度离心获得纯度更高的线粒体。
产品内容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 250毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 40毫升
HEPENGBIO净化液（Reagent C） 10毫升
HEPENGBIO强化液（Reagent D） 5毫升
HEPENGBIO保存液（Reagent E） 100毫升
HEPENGBIO活性液（Reagent F） 200微升
HEPENGBIO高纯液（Reagent G） 55毫升
产品说明书1份
保存方式
保存HEPENGBIO净化液（Reagent C）和HEPENGBIO活性液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO高纯液（Reagent G），避免光照；HEPENGBIO裂解液（Reagent B）和HEPENGBIO保存液（Reagent E）严格无菌操作；6月
用户自备
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
1.5毫升离心管：用于样品保存的容器
4℃台式离心机：用于样品操作
4℃超速离心机：用于样品操作
DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞
超声仪：用于裂解细胞
实验步骤
一、 物理处理法
实验开始前，将试剂盒里的HEPENGBIO活性液（Reagent F）冻融，然后移出20微升HEPENGBIO活性液（Reagent F）和 1毫升HEPENGBIO净化液（Reagent C）到4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）里，混匀后，置入冰槽里，标记为HEPENGBIO裂解工作液。然后进行下列操作。
1． 准备1个无菌的50毫升锥形离心管
2． 轻轻混匀10至20毫升新鲜（2小时内抽取的静脉血）的抗凝全血样品
3． 移入到50毫升锥形离心管
4． 放进台式离心机离心15分钟，速度为200g
5． 小心移取上清液到新的50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群
6． 用手指轻弹离心管2至3下，使细胞颗粒群松动
7． 加入10毫升预冷的HEPENGBIO清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
8． 放进台式离心机离心15分钟，速度为200g
9． 小心移取上清液合并到上述50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群（扔掉含有细胞颗粒群的离心管）
10． 放入含有上清液的离心管到台式离心机离心15分钟，速度为200g
11． 小心移取上清液到新的50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群（扔掉含有细胞颗粒群的离心管）――此步骤获得血小板富集血清
12． 放入含有上清液的离心管到台式离心机离心20分钟，速度为2000g
13． 小心抽掉上清液
14． 加入10毫升预冷的HEPENGBIO清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
15． 放入台式离心机离心20分钟，速度为2000g
16． 小心抽去上清液（注意：如果暂时停止操作，须暂时放进－70℃冰箱里）――此步骤获得纯化的血小板
17． 加入5毫升预冷的HEPENGBIO裂解工作液
18． 涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群
19． 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约10下）（注意：参见注意事项11）
20． 将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管
21． （选择步骤）置于超声仪枪头下，离心管在冰槽里
22． （选择步骤）超声功率为60％（或150赫兹）猝击10秒，间隙30秒，10个循环
23． 放进4℃台式离心机离心20分钟，速度为2000g
24． 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除未溶解的细胞
25． 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
26． 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
27． 加入500微升HEPENGBIO保存液（Reagent E），充分混匀沉淀颗粒
28． 放进－70℃冰箱里备用或放进冰槽里继续后续操作
29． 移取5.5毫升的HEPENGBIO高纯液（Reagent G）到6毫升超速离心管（注意：使用前摇匀HEPENGBIO高纯液(Reagent G)）
30． 轻轻加入500微升线粒体混匀液在HEPENGBIO高纯液（Reagent G）的上面，避免震动
31． 放进4℃超速离心机离心45分钟，速度为40000g
32． 小心取出超速离心管：可见下端棕色或乳黄色样品带（注意：在其上端可能有溶酶体样品带）
33． 小心抽去线粒体样品带以上的液体
34． 小心收集线粒体样品带到2毫升离心管（注意：用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）——此步骤获得高纯线粒体样品
35． 加入1至2毫升HEPENGBIO保存液（Reagent E）
36． 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
37． 小心抽去上清液
38． （选择步骤）重复实验步骤35至38一次
39． 加入500微升HEPENGBIO保存液（Reagent E），混匀
40． 即刻移入到预冷的1.5毫升离心管
41． 放进－70℃冰箱里保存
二、 化学处理法
实验开始前，将试剂盒里的HEPENGBIO活性液（Reagent F）冻融，然后移出20微升HEPENGBIO活性液（Reagent F）和 1毫升HEPENGBIO净化液（Reagent C）到4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）里，混匀后，置入冰槽里，标记为HEPENGBIO裂解工作液。然后进行下列操作。
1． 准备1个无菌的50毫升锥形离心管
2． 轻轻混匀10至20毫升新鲜（2小时内抽取的静脉血）的抗凝全血样品
3． 移入到50毫升锥形离心管
4． 放进台式离心机离心15分钟，速度为200g
5． 小心移取上清液到新的50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群
6． 用手指轻弹离心管2至3下，使细胞颗粒群松动
7． 加入10毫升预冷的HEPENGBIO清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
8． 放进台式离心机离心15分钟，速度为200g
9． 小心移取上清液合并到上述50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群（扔掉含有细胞颗粒群的离心管）
10． 放入含有上清液的离心管到台式离心机离心15分钟，速度为200g
11． 小心移取上清液到新的50毫升锥形离心管，留下200微升液体，以防抽取松动的细胞颗粒群（扔掉含有细胞颗粒群的离心管）――此步骤获得血小板富集血清
12． 放入含有上清液的离心管到台式离心机离心20分钟，速度为2000g
13． 小心抽掉上清液
14． 加入10毫升预冷的HEPENGBIO清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
15． 放入台式离心机离心20分钟，速度为2000g
16． 小心抽去上清液（注意：如果暂时停止操作，须暂时放进－70℃冰箱里）――此步骤获得纯化的血小板
17． 入5毫升预冷的HEPENGBIO裂解工作液
18． 涡旋震荡5秒，充分混匀
19． 在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
20． 加入500微升预冷的HEPENGBIO强化液（Reagent D）
21． 涡旋震荡5秒，充分混匀
22． 在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项11）
23． 加入5毫升预冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E），轻轻摇动试管混匀
24． 放进4℃台式离心机离心20分钟，速度为2000g
25． 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除未溶解的细胞
26． 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
27． 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
28． 加入500微升HEPENGBIO保存液（Reagent E），充分混匀沉淀颗粒
29． 放进－70℃冰箱里备用或放进冰槽里继续后续操作
30． 移取5.5毫升的HEPENGBIO高纯液（Reagent G）到6毫升超速离心管（注意：使用前摇匀HEPENGBIO高纯液(Reagent G)）
31． 轻轻加入500微升线粒体混匀液在HEPENGBIO高纯液（Reagent G）的上面，避免震动
32． 放进4℃超速离心机离心45分钟，速度为40000g
33． 小心取出超速离心管：可见下端棕色或乳黄色样品带（注意：在其上端可能有溶酶体样品带）
34． 小心抽去线粒体样品带以上的液体
35． 小心收集线粒体样品带到2毫升离心管（注意：用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）——此步骤获得高纯线粒体样品
36． 加入1至2毫升HEPENGBIO保存液（Reagent E）
37． 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
38． 小心抽去上清液
39． （选择步骤）重复实验步骤36至38一次
40． 加入500微升HEPENGBIO保存液（Reagent E），混匀
41． 即刻移入到预冷的1.5毫升离心管
42． 放进－70℃冰箱里保存
注意事项
1． 本产品为10次（10至20毫升全血/次）操作
2． 其它实际操作的全血容量与试剂使用量按比例调整：例如40毫升全血，试剂用量加倍
3． 操作时，避免污染母液，尤其是HEPENGBIO裂解液（Reagent B）和HEPENGBIO保存液（Reagent E）
4． 操作时，须戴手套
5． 建议使用新鲜全血：2小时内的全血为理想状态，不要超过24小时
6． 全血样品采集须使用EDTA二钾血液抗凝液、ACD血液抗凝液，或肝素钠血液抗凝液
7． 建议使用足够的样品量
8． 血小板提取量因人而异；如果不足，建议增加全血量
9． 线粒体操作均须在4℃或以下状态下进行
10． 建议严格控制操作时间
11． 物理处理法是优先推荐的技术处理
12． 本产品所获得的线粒体纯度（可达到99％）和产量最为理想
13． 使用HEPENGBIO高纯液（Reagent G）前，须摇匀后加入；并注意避免污染母液
14． 根据超速离心管的大小调整HEPENGBIO高纯液（Reagent G）的使用量或在样品上面加上石蜡油填满
15． 每毫升全血平均可获得2 X 108血小板
16． 通常10毫升全血的血小板线粒体含量为10至25微克线粒体蛋白
17． 如果需要计量线粒体，稀释后数分钟内完成，否则线粒体将分解
18． 线粒体正常活性测定方法是：CITRATE SYNTHASE活性、氧化磷酸化、细胞色素吸收峰谱等
19． 线粒体内外膜完整测定方法是：CYTOCHROME C OXIDASE活性和荧光JC染色
20． 本公司提供线粒体套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、线粒体溶解等
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
