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技术文章
组织醛糖还原酶（aldose reductase；AR）活性光度法定量检测试剂盒产品说明书@主要用途
点击次数：2722 发布时间：2024/7/18 15:11:48
HEPENGBIO组织醛糖还原酶（aldose reductase；AR）活性光度法定量检测试剂盒
产品说明书
主要用途
HEPENGBIO组织醛糖还原酶（aldose reductase；AR）活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过底物葡糖醛酸，在醛糖还原酶的催化作用下，产生山梨醇，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化后峰值的降低，即采用光度法来测定样品中酶活性的方法。其适用于各种组织（动物、人体、昆虫等）裂解悬液样品醛糖还原酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景
醛糖还原酶（aldose reductase；ALR2，EC1.1.1.21）是一种NADPH依赖性氧化还原酶，属于醛酮还原酶（aldo-keto reductase；AKR）超级家族成员之一，催化各种醛类和羰基化合物的还原反应，特别是葡萄糖还原为山梨醇的反应，是葡萄糖代谢中多元醇（polyols）通路的一步反应的关键限速酶。醛糖还原酶主要在人体肝组织、晶状体、视网膜、雪旺氏细胞、胎盘组织和红细胞中表达。醛糖还原酶与糖尿病并发症相关，包括白内障、神经病变、肾脏病变、视网膜病变、动脉粥样硬化等，由此成为药物靶标。基于底物葡糖醛酸（glucuronate），在醛糖还原酶的催化作用下，产生山梨醇（sorbitol），同时其辅酶因子还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；β-NADPH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；β-NADP），通过测定吸光值的变化（340nm波长），来定量分析醛糖还原酶的活性。其反应系统为：
ALR2
Glucuronate + β-NADPH → sorbitol + β-NADP
产品内容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 60毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 10毫升
HEPENGBIO缓冲液（Reagent C） 20毫升
HEPENGBIO反应液（Reagent D） 2毫升
HEPENGBIO底物液（Reagent E） 2毫升
HEPENGBIO阴性液（Reagent F）500微升
产品说明书 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里；HEPENGBIO反应液（Reagent D）和HEPENGBIO底物液（Reagent E）避免光照；效期6个月
用户自备
1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
（微型）台式离心机：用于样品操作
比色皿或96孔板：用于光度的容器
分光光度仪或酶标仪：用于样品光度分析
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后进行下列操作。
一、 样品准备
1． 手术取出动物组织，并秤重以确定500毫克组织重量
2． （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
3． （选择步骤）加入3毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 移入到一个液氮冻存管
5． 即刻放进液氮罐过夜
6． 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
7． 放进一个15毫升锥形离心管
8． 加入预冷的500微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B）
9． 转移到预冷的1.5毫升离心管
10． 强力涡旋震荡30秒，充分混匀
11． 置于冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）
12． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
13． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
14． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒）
15． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、 测定准备
1． 开启并设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长340nm，间隔2分钟，读数6次（共10分钟），并置零
2． 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；HEPENGBIO底物液（ReagentE）避免光照
3． HEPENGBIO缓冲液（ReagentC）室温下均衡温度
三、 背景对照测定
1． 移取750微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入100微升HEPENGBIO反应液（Reagent D）
3． 加入100微升HEPENGBIO底物液（Reagent E）
4． 上下倾倒数次，混匀
5． 在25℃温度下孵育3分钟
6． 加入50微升HEPENGBIO阴性液（Reagent F）
7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（0分钟读数－10分钟读数）
四、 样品测定
1． 移取750微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入100微升HEPENGBIO反应液（Reagent D）
3． 加入100微升HEPENGBIO底物液（Reagent E）
4． 上下倾倒数次，混匀
5． 在25℃温度下孵育3分钟
6． 加入50微升待测样品（50微克蛋白）（注意：样品须清澈）
7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（0分钟读数－10分钟读数）
五、计算样品活性
[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 1（体系容量；毫升）]÷[0.05（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X1（光径距离；厘米）X 10（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔NADPH/分钟
六、 酶标仪测定
1． 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
2． 分别移取150微升HEPENGBIO缓冲液（ReagentC）到96孔板里
3． 分别加入20微升HEPENGBIO反应液（ReagentD）
4． 分别加入20微升HEPENGBIO底物液（ReagentE）
5． 轻轻摇动96孔板
6． 在25℃温度下孵育3分钟
7． 分别加入10微升HEPENGBIO阴性液（ReagentF）或待测样品（20微克蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
8． 轻轻摇动96孔板
9． 即刻放进酶标仪检测：获得0分钟和10分钟读数
10． 活性计算
[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.20（体系容量；毫升）]÷[0.01（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 0.6（光径距离；厘米）X 10（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔NADPH/分钟
注意事项
1． 本产品为20次（比色皿）和100次（96孔板）操作，包括背景对照
2． 操作时，须戴手套
3． 系统操作过程中，背景测定只需1次
4． 样品须澄清，至关重要
5． 孵育完成后即刻光度测定
6． 测定值由高到低变化；测定持续10分钟
7． 样本测定10分钟读数低于0分钟读数表明具有酶活性
8． 光度测定后，比色皿须清洗底
9． 建议待测样本蛋白浓度为50微克/50微升（本公司提供HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒）
10． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
11． 醛糖还原酶单位活性定义为：在25℃，pH6.2条件下，每分钟内能够转化1微摩尔葡糖醛酸至山梨醇所需的酶量作为一个活性单位
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
