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技术文章
HEPENGBIO组织总抗氧化能力比色法定量检测试剂盒说明书使用方法你知道吗？
点击次数：2688 发布时间：2024/7/18 15:07:28
HEPENGBIO组织总抗氧化能力比色法定量检测试剂盒产品说明书
主要用途
HEPENGBIO组织总抗氧化能力（TAC）比色法定量检测试剂是一种旨在通过过硫酸钾的参与，使染料ABTS氧化，在抗氧化剂的存在下，通过分光光度仪，观察其峰值下降的变化，来定量检测对应于标准水溶性生育酚Trolox的总抗氧化能力，即抑制氧化等值浓度的方法。适用于各种新鲜组织（动物、人体、昆虫等）的总抗氧化能力检测。产品严格无菌，即到即用，操作简易，性能稳定。
技术背景
超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hyｄroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxylradical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitriteanion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinoneradical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡，甚而导致诸如冠心病、风湿性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。在生物系统内，通过抗氧化酶例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等，大分子，例如白蛋白、铜蓝蛋白（ceruloplasmin；CER）、铁蛋白（ferritin）和抗氧化因子，例如生育醇、类胡萝卜素、抗坏血酸、还原性谷胱甘肽和尿酸胆红素（bilirubin）等，产生抗氧化能力，即捕获自由基的能力，达到消除或降低ROS的损害。通过过硫酸钾（potassium persulfate）氧化2,2’-连氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazoline- 6-sulfonic acid)，diammonium salt；ABTS）产生的ABTS自由基，衡量体系中抗氧化剂捕获自由基、消耗抗氧化剂的能力，在分光光度仪（730nm波长）的帮助下，观察其峰值下降的变化，并与标准化抗氧化剂水溶性生育酚Trolox对照。
产品内容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 250毫升
HEPENGBIO低渗液（Reagent B） 25毫升
HEPENGBIO缓冲液（Reagent C） 20毫升
HEPENGBIO染色液A（Reagent D1） 1管
HEPENGBIO染色液B（Reagent D2） 1毫升
HEPENGBIO氧化液（Reagent E） 1毫升
HEPENGBIO标准液（Reagent F） 300微升
产品说明书 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里，保证6月
用户自备
15毫升锥形离心管：用于组织样品操作的容器
2毫升离心管：用于组织样品操作的容器
1.5毫升离心管：用于组织裂解悬液存放和标准样品配制的容器
4℃微型台式离心机：用于样品操作
超声仪：用于破碎组织细胞
96孔板：用于比色的容器
分光光度仪或酶标仪：用于比色分析
实验步骤
一、 样品准备
1． 手术取出动物组织，并秤重以确定组织重量200毫克
2． 移入到一个液氮冻存管
3． 即刻放进液氮罐过夜
4． 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
5． 放进一个15毫升锥形离心管
6． 加入2毫升4℃预冷的 HEPENGBIO清理液（Reagent A）
7． 强力涡旋震荡30秒，充分混匀
8． 转移到4℃预冷的2毫升离心管
9． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
10． 小心抽去上清液
11． 加入1毫升4℃预冷的 HEPENGBIO清理液（Reagent A），混匀
12． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
13． 小心抽去上清液
14． 重复实验步骤11至13二次
15． 加入500微升HEPENGBIO低渗液（Reagent B），混匀
16． 置于200瓦超声仪枪头下，离心管在冰槽里
17． 超声功率为100％，猝击10秒，2个循环
18． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415）
19． 移取上清液到新的4℃预冷的1.5毫升离心管
20． 移取10微升进行蛋白定量检测（建议使用HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒）
21． 使用HEPENGBIO清理液（Reagent A）调整蛋白浓度为100微克/10微升
22． 置于冰槽里待测
二、标准液准备
1． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
2． 移取50微升HEPENGBIO标准液（Reagent F）到1号管
3． 小心移取10微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）和40微升HEPENGBIO标准液（Reagent F）到2号管，混匀
4． 小心移取20微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）和30微升HEPENGBIO标准液（Reagent F）到3号管，混匀
5． 小心移取30微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）和20微升HEPENGBIO标准液（Reagent F）到4号管，混匀
6． 小心移取50微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到5号管
7． 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表
管号 | HEPENGBIO缓冲液（Reagent C） | HEPENGBIO标准液（Reagent F） | 测定体系 标准 Trolox浓度 |
1 | 0微升 | 50微升 | 150微摩尔/升 |
2 | 10微升 | 40微升 | 120微摩尔/升 |
3 | 20微升 | 30微升 | 90微摩尔/升 |
4 | 30微升 | 20微升 | 60微摩尔/升 |
5 | 50微升 | 0 | 0 |
三、 样品测读
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置于室温下融化，移取1毫升HEPENGBIO染色液B（Reagent D2）到1管HEPENGBIO染色液A（Reagent D1）里，混匀，置于暗室里室温下孵育过夜（16小时）后，标记为HEPENGBIO染色工作液，避免光照。然后进行下列操作。
1． 准备1个96孔板，做好标记：空白对照孔、标准对照孔、样品孔
2． 分别移取200微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到96孔板里的每个孔里
3． 分别加入20微升HEPENGBIO染色工作液
4． 分别加入20微升HEPENGBIO氧化液（Reagent E）
5． 加入10微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到空白对照孔
6． 加入10微升上述配制的HEPENGBIO标准液（Reagent F）到相应标准对照孔里
7． 加入10微升组织裂解样品（100微克蛋白总量）到样品孔里
8． 轻轻摇动96孔板，使其混匀
9． 室温下孵育1分钟
10． 即刻放进酶标仪里测读：730nm波长
11． 分析结果：
1） 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位（OD730nm）；横座标（X轴）为标准Trolox浓度（微摩尔/升）
2） 空白对照孔为最大吸光单位（OD730nm）读数
3） 标准对照孔和样品孔为实际吸光单位（OD730nm）读数
4） 根据标准曲线获得样品对应Trolox浓度（微摩尔/升）
5） 计算样品实际总抗氧化能力
【根据标准曲线获得样品对应Trolox浓度（微摩尔/升）X 0.25（体系容量；毫升）X样品稀释倍数】÷0.01（样品容量；毫升）＝（微摩尔/升TROLOX等值）
6） 根据下列公式计算测定体系中样品量的总抗氧化能力（实际抑制百分率）
【（空白对照孔吸光单位读数－实际吸光单位读数）÷空白对照孔吸光单位读数】X100％
7） IC50：50％抑制率所需的样品单位：TROLOX等值或样品蛋白浓度（毫克/毫升）或样品容量（微升）
X（所需样品单位）＝（已知样品单位÷实际抑制百分率）X 50％
注意事项
1． 本产品为50次操作
2． 本产品测试范围为高浓度30至150微摩尔
3． 操作时，须戴手套
4． 样品制备的所有操作均须在4℃状态下进行
5． 测试前，样品须新鲜收集
6． 样品须清澈
7． 样品避免含有Tris、EDTA和还原剂等
8． 空白对照孔的吸光读数应为2.0以上，如果低于1.5，不能用于高浓度检测，须增加HEPENGBIO染色工作液的室温孵育时间
9． HEPENGBIO染色工作液避免反复在室温空气中久置。如果空白对照孔的吸光读数为3.5以上，建议使用无离子水稀释到2.5至3.0则可
10． 样品读数越低，抗氧化能力越高
11． 样本量不宜超过20微升
12． 可以使用比色皿检测
13． 如果样品抗氧化剂浓度过高或过低，建议稀释或增加样品浓度
14． 如果测试样品很多，建议使用排枪移液
15． 如果用户没有730nm波长滤波器，可以使用640nm至810nm之间的任一波长替代；或者使用405nm波长替代
16． 本公司提供低浓度测试试剂产品
17． 本公司提供系列抗氧化分析试剂产品
本产品仅供科研使用,请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
