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技术文章
γ-氨基丁酸(GABA) 含量试剂盒说明书使用方法你知道吗？
点击次数：2858 发布时间：2024/7/18 11:31:21
γ-氨基丁酸(GABA) 含量试剂盒说明书
( 分光法48样)
一、产品简介：
4-氨基丁酸(GABA) 广泛分布在动植物体中。在动物体内GABA 几乎只存在于神经 组织中。在植物中如豆属、参属、中草药等的种子、根茎和组织液中都含有G A B A， 且与植物的环境应激反应有关。
4-氨基丁酸(GABA) 在碱性溶液中与次氯酸盐和苯酚反应生成蓝绿色物质，通过检 测该有色物质在645nm波长处的值，即可得出样本中GABA 的含量。
二、试剂盒的组分与配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 |
|
试剂一 | 液体40mL×1瓶 | 4℃保存 |
|
试剂二 | 液体10mL×1瓶 | 4℃保存 |
|
试剂三 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 |
|
标准品 | 粉体 mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
三、所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径1cm)、可调式移液枪、水浴锅、离心机、 研钵、蒸馏水。
四、γ-氨基丁酸(GABA) 含量测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实 验样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：
称取约0. 1g 组织样本加入研钵中，加入1mL 提取液，在冰上进行匀浆，12000rpm，4℃或室温离心10min ，取上清液待测。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g) ：提取液(mL)为1：5~ 10的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次)；12000rpm 4℃离心10min ，取上清，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量(104) ：提取液 (mL) 为500~ 1000：1的比例进行提取。
③ 液体样本：澄清的液体样本直接测定，若浑浊则离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热30min ，调节波长到645nm ，蒸馏水调零。
② 所有试剂解冻至室温(25℃)。
③在 EP 管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 100 | 100 |
试剂一 | 60 | 660 |
试剂二 | 200 |
|
试剂三 | 400 |
|
混匀，沸水浴 (95- 100℃)10min ，冰浴至室温，呈现蓝绿色颜 | ||
1
色，若浑浊需 12000rpm 离心5min ，取全部澄清上清液转移至 1mL玻璃比色皿(光径1cm) 中，于645nm 处读取各管的A 值， △A=A 测定-A 对照(每个样本需做一个自身对照)。 |
【注】1.若测定管的A 值大于1，则需将样本进行稀释 (用蒸馏水稀释) ，稀释倍数D需代入计算公式重新计算。
2.若A 测定-A 对照的差值在零附近徘徊，则可增加样本取样量(如增至 0.2g)， 则取样质量W 代入计算公式重新计算。
五、结果计算：
1、标准曲线：y = 0.0086x - 0.0033，x 为标准品质量(μg)，y 为吸光值ΔA。
2、按样本质量计算:
GABA 含量(μg/g 重量)=[(ΔA+0.0033) ÷0.0086]÷(W×V1÷V) ×D
= 1162.8×(ΔA+0.0033) ÷W×D
3 、按细胞数量计算：
GABA 含量(μg/ 104cell)=[(ΔA+0.0033) ÷0.0086]÷(500×V1÷V) ×D=2.33×(ΔA+0.0033) ×D4 、液体中GABA 含量计算：
GABA 含量(μg/mL)=[(ΔA+0.0033) ÷0.0086]÷V1×D= 1162.8×(ΔA+0.0033)×D
V---提取液体积，1mL；
D---稀释倍数,未稀释即为1；
500---细胞数量，万。
V1---样本加入体积，0. 1mL；
W---样本取样质量；
附：标准曲线制作过程：
1 标准品母液(2mg/mL)：标准品临用前加1mL 蒸馏水溶解。
2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2mg/mL。也可根据实际样本来调整 标准品浓度。
3 按照测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
