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技术文章
动物组织V型ATP酶（V type ATPase ）活性酶连续反应光度法定量检测试剂盒注意事项有哪些？
点击次数：2829 发布时间：2024/7/18 11:30:34
HEPENGBIO动物组织V型ATP酶（V type ATPase）活性酶连续反应光度法定量
检测试剂盒产品说明书
主要用途
HEPENGBIO动物组织V型ATP酶（V type ATPase）活性酶连续反应光度法定量检测试剂是一种旨在使用V型ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环反应系统，通过排除P型和F型ATP酶干扰的前提下，测定ATP水解产生的ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光度法测定其氧化后峰值的变化，以此进行测算单位酶活性的方法。其适合于各种动物组织裂解悬液，以及内涵体、溶酶体、囊泡体、微粒体等V型ATP酶的特异活性检测。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。
技术背景
腺苷三磷酸酶，又称为ATP酶（adenosine triphosphatase；ATPase或ATPphosphohydrolase；EC3.6.1.3），属于磷酸水解酶，可以催化含磷的酸酐分解，即催化三磷酸腺苷分解为二磷酸腺苷和无机磷。ATP酶的去磷酸化反应释放出能量，成为细胞生命代谢的能源。ATP酶为跨膜蛋白（transmembrane），帮助传输各种代谢分子进出细胞。根据ATP酶的结构和功能，分为五类不同的ATP酶，即F、V、A、P和E型。F型，又称为F1F0型，主要在线粒体、叶绿体或细菌细胞膜上，进行氧化磷酸化或光合作用；P型，又称为E1E2型，存在于细菌和真核细胞膜和细胞器上，其功能在于水解ATP获得能量，跨膜运输各种化学分子，包括Ca2+传输性、Na+-K+ /H+-K+传输性、H+传输性和所有细菌型等，其中胃氢/钾ATP酶，一种与胃酸分泌相关的质子泵，属于这一类型。V型，又称为V1V0型，主要存在于真核细胞的液泡（vacuole）中。A型，又称为A1A0型，存在于古生菌（archaea）中。E型，为细胞表面的酶。其中V型，也称为氢V型ATP酶，主要存在于所有真核细胞的液泡或囊泡（vacuole或vesicle）中，包括突触囊泡、储存囊泡、分泌性囊泡、高尔基体囊泡、披网格蛋白囊泡（clathrin-coated vesicle），以及溶酶体、内涵体、微粒体、血小板致密颗粒等。V型ATP酶由14种不同的多肽构成环形结构：周边为400至600KD的V1复合物，中间为150至350KD的V0完整膜复合物，总共是800KD。其功能进行氢离子转运，以调节组织细胞的酸碱环境。基于底物ATP，通过排除P型ATP酶（钒酸盐；vanadate）和F型ATP酶（寡霉素；oligomycin）干扰的前提下，受到组织细胞中的V型ATP酶的水解，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），所产生的峰值变化（340nm），来定量分析V型ATP酶的特异活性。其反应系统为：
V-ATPase
ATP + H2O → ADP + Pi
pyruvate kinase
Phosphoenolpyruvate + ADP → pyruvate+ ATP
lactate dehydrogenase
pyruvate + NADH → lactate + NAD+
（高吸收峰） （低吸收峰）
产品内容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 60毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 10毫升
HEPENGBIO缓冲液（Reagent C） 20毫升
HEPENGBIO酶促液（Reagent D） 500微升
HEPENGBIO反应液（Reagent E） 2.5毫升
HEPENGBIO底物液（Reagent F） 2.5毫升
HEPENGBIO阴性液（Reagent G） 1毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存HEPENGBIO清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；HEPENGBIO底物液（Reagent F），避免光照，保证6月
用户自备
15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器
微型台式离心机：用于样品制备
培养箱：用于反应孵育
比色皿：用于光度分析的容器
分光光度仪：用于光度分析
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；HEPENGBIO底物液（ReagentF）注意避光。然后进行下列操作。
一、 样品准备（总蛋白制备）
1． 手术取出动物组织，并秤重以确定500毫克组织重量
2． （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
3． （选择步骤）加入3毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 移入到一个液氮冻存管
5． 即刻放进液氮罐过夜
6． 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
7． 放进一个15毫升锥形离心管
8． 加入预冷的500微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B）
9． 转移到预冷的1.5毫升离心管
10． 强力涡旋震荡30秒，充分混匀
11． 置于冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）
12． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
13． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
14． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒）
15． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、测定准备
1． 准备好上述待测样品，置于冰槽里
2． 设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长为340nm，间隔5分钟，读数5次（共20分钟），并置零
3． HEPENGBIO缓冲液（ReagentC）室温下均衡温度
三、 背景对照测定
1． 移取730微升HEPENGBIO缓冲液（ReagentC）到新的比色皿
2． 加入20微升HEPENGBIO酶促液（ReagentD）
3． 加入100微升HEPENGBIO反应液（ReagentE）
4． 加入100微升HEPENGBIO底物液（ReagentF）
5． 放进37℃培养箱里静置3分钟
6． 加入50微升HEPENGBIO阴性液（ReagentG）
7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数20分钟
四、 样品活性测定
1． 移取730微升HEPENGBIO缓冲液（ReagentC）到新的比色皿
2． 加入20微升HEPENGBIO酶促液（ReagentD）
3． 加入100微升HEPENGBIO反应液（ReagentE）
4． 加入100微升HEPENGBIO底物液（ReagentF）
5． 放进37℃培养箱里静置3分钟
6． 加入50微升待测样品（注意：100微克总蛋白；样品须溶解）
7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数20分钟
五、 计算样品活性
[（样品读数－背景读数）X 1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.05（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 10或20（反应时间；分钟）]＝单位/毫升
或者
[（样品读数－背景读数）X 1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.1（样品蛋白量；毫克）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 10或 20（反应时间；分钟）]＝单位/毫克
单位＝微摩尔NADH/分钟
注意事项
1． 本产品为20次操作，包括背景对照
2． 操作时，须戴手套
3． 系统操作过程中，背景测定只需1次
4． 样品忌用磷酸缓冲溶液
5． 建议使用动物组织微粒体、囊泡或溶酶体样品；本公司提供的HEPENGBIO动物组织膜性囊泡（RSOV和IOV）制备试剂盒
6． 加入样品启动反应后3秒内即刻光度测定
7． 反应测定值由高到低变化；测定可以持续20分钟
8． 测定值由高到低变化，即0分钟测定读数高于10分钟或20分钟测定读数，表明有酶活性
9． 光度测定后，比色皿须清洗
10． 建议待测样本蛋白浓度为100微克/50微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；注意计算公式的调整（本公司提供HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒
11． 可以使用V型ATP酶抑制剂巴佛洛霉素A1（bafilomycin A1）作为抑制剂对照或阴性对照
12． V型ATP酶活性单位浓度定义：在37℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
13． 本公司提供系列ATP酶类技术产品
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
