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技术文章
蔗糖-葡萄糖-果糖含量 (己糖激酶法) 测定试剂盒-微板法说明书
点击次数：2716 发布时间：2024/7/18 11:27:55
蔗糖-葡萄糖-果糖含量(己糖激酶法) 测定试剂盒-微板法说明书
一、产品简介：
在大多数植物、水果和食品中发现蔗糖，葡萄糖和果糖。蔗糖和果糖在特异性酶的作 用下转化为葡萄糖，葡萄糖在己糖激酶等酶复合物作用下，同时使NADP+还原成NADPH，
通过检测 340nm 下NADPH 的增加量，分别计算得到蔗糖、葡萄糖和果糖的含量。
二、测试盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 1mL×1支 | 4℃保存 | 可分装冻存，防止反复冻融。 |
试剂二 | 粉剂×1支 | -20℃保存 | 临用前甩几下或离心，使粉剂落入 底部，再加2. 1mL 蒸馏水溶解备用。 |
试剂三 | 35mL 液体×1瓶 | 4℃保存 |
|
试剂四 |
粉剂×2支 |
-20℃保存 | 临用前甩几下或离心，使粉剂落入 底部，每支再加1. 1mL 蒸馏水溶解 备用，可分装冻存，防止反复冻融。 |
试剂五 |
液体μL×1支 |
-20℃保存 | 临用前甩几下或离心，使微量液体 落入底部，再加1. 1mL 蒸馏水溶解 备用，可分装冻存，防止反复冻融。 |
三、所需的仪器和用品：
酶标仪、96孔板、离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
四、蔗糖-葡萄糖-果糖含量测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！
①组织样本：0. 1g 组织样本(水分充足的样本建议取0.2g 左右) ，加1mL 的蒸馏水研 磨，粗提液全部转移到EP 管中，12000rpm ，常温离心10min ，上清液待测。注：若 组织样本蛋白含量很高，进行脱蛋白处理。
【注】：做实验前可以选取几个样本，找出适合本次检测样本的稀释倍数D ，果实样 本含糖量较高，可稀释20-40倍；叶片样本可稀释2-5倍。
② 液体样品：近似中性的澄清液体样本可直接检测；若为酸性样本则需先用NaOH(2M) 调PH 值约7.4，然后室温静置30min，取澄清液体直接检测。
【注】 ：可选取几个样本，进行不同倍数的稀释，选取适合本次样本的稀释倍数D。
2、上机检测：
① 酶标仪预热30min 以上，调节波长到340nm。
② 用前使所有试剂解冻或30℃水浴15-30min。
③ 为了减少操作误差，建议使用排枪。
④依次在96孔板中加入：
试剂名称(μL) | 测定管M | 对照管M (仅做一次) | 测定管N | 对照管N (仅做一次) |
样本 | 10 |
| 10 |
|
试剂一 | 10 | 10 |
|
|
试剂二 | 10 | 10 | 10 | 10 |
试剂三 | 160 | 170 | 170 | 180 |
混匀，30℃孵育5min后于340nm处读取各管的A1值 | ||||
试剂四 | 10 | 10 | 10 | 10 |
混匀，30℃反应30min于340nm处读取各管的A2值(若A值继续增加，需 延长反应时间，直至2分钟内的吸光值保持不变) | ||||
试剂五 |
|
| 10 | 10 |
混匀，30℃反应20min于340nm处读取各管的A3值(若A值继续增加，需 延长反应时间，直至2分钟内的吸光值保持不变) | ||||
【注】1.测定管M和对照管M的值可以在读取A3的时候再重读一次，依此也可判读测 定管M在30分钟读取A2时是否反应完全。
2.检测是否反应完全，在每次要读值的时候，可改用时间扫描：3min，间隔1min， 依此判读反应是否完全。然后再读取各测定管的A值。
3.若A3值超过1.5，可减少样本加样量V1：如由10μL减至5μL ，则试剂三相应 增加；或对样本进行稀释，则改变后的V1和稀释倍数D代入公式计算。
4.若ΔA的差值较小如小于0.01，可增加样本量：如由10μL增至30μL ，则试剂 三相应减少。
五、结果计算：
ΔA蔗糖=[ (A2-A1)测定管M-(A2-A1)对照管M]-ΔA葡萄糖；
ΔA葡萄糖=(A2-A1)测定管N-(A2-A1)对照管N；
ΔA果糖=(A3-A2)测定管N-(A3-A2)对照管N；
1、按样本质量计算：
蔗糖含量(mg/g鲜重)=[ΔA蔗糖÷(ε×d)]×V2×103×342.3÷(V1÷V×W)
=2. 1733×ΔA蔗糖÷W×D
葡萄糖含量(mg/g鲜重)=[ΔA葡萄糖÷(ε×d)]×V2×103×180. 16÷(V1÷V×W)= 1.1439×ΔA葡萄糖÷W×D
果糖含量(mg/g鲜重)=[ΔA果糖÷(ε×d ×(V3÷V2)]×V3×103×180. 16÷(V1÷V×W) = 1. 1439×ΔA果糖÷W×D
2、按照体积计算：
蔗糖含量(mg/mL)=[ΔA蔗糖÷(ε×d)]×V2×103×342.3÷V1
=2. 1733×ΔA蔗糖×D
葡萄糖含量(mg/mL)=[ΔA葡萄糖÷(ε×d)]×V2×103×180. 16÷V1
= 1. 1439×ΔA葡萄糖×D
果糖含量(mg/mL)=[ΔA果糖÷(ε×d ×(V3÷V2)]×V3×103×180. 16÷V1
= 1. 1439×ΔA果糖×D
ε---NADPH的摩尔吸光系数为6.3×103L/mol/cm； | d---光径距离，0.5cm； |
V---提取液体积，1mL； | V1---样本体积，10μL=0.01mL； |
V2---反应总体积，200μL=2×10-4L； | V3---反应总体积，210μL=2. 1×10-4L； |
葡萄糖分子量--- 180. 16； | 果糖分子量--- 180. 16； |
蔗糖分子量---342.3； |
|
W---样本质量，g； | D---稀释倍数，未稀释即为1。 |
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
