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技术文章
分离线粒体纯度双酶法（SDH/AP）检测试剂盒产品说明书@分析方法
点击次数：2675 发布时间：2024/7/18 11:26:35
HEPENGBIO分离线粒体纯度双酶法（SDH/AP）检测试剂盒产品说明书
主要用途
HEPENGBIO分离线粒体纯度双酶法（SDH/AP）检测试剂是一种旨在通过反应系统测定样品中特异性琥珀酸脱氢酶和酸性磷酸酶的活性，即采用比色法测定其吸光峰值的变化，以此进行分析酶活性的方法。其适合于各种纯化线粒体样品的纯度分析：即琥珀酸脱氢酶阳性和酸性磷酸酶阴性。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。
技术背景
琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase；SDH；EC 1.3.99.1）是三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle；TCA）或Krebs循环中与细胞线粒体膜相关的重要元素，位于线粒体内膜，参与细胞呼吸链，是线粒体的蛋白分子标记。酸性磷酸酶（acid phosphatase；ACP；EC 3.1.3.2），是一种酸性水解酶（acid hydrolase）和去磷酸化酶，即磷酸单酯酶（phosphomonoesterase），在酸性环境下，水解磷酸单酯化合物而释放出无机磷。正常情况下，位于溶酶体内，作为溶酶体的分子标记。通过检测琥珀酸脱氢酶，以证明线粒体的存在；检测酸性磷酸酶，分析其它细胞器的污染与否。
产品内容
HEPENGBIO缓冲液A（Reagent A） 5毫升
HEPENGBIO底物液A（Reagent B） 200微升
HEPENGBIO反应液A（Reagent C1） 1管
HEPENGBIO反应液B（Reagent C2） 1毫升
HEPENGBIO阴性液（Reagent D） 1毫升
HEPENGBIO缓冲液B（Reagent E） 5毫升
HEPENGBIO底物液B（Reagent F） 400微升
HEPENGBIO终止液（Reagent G） 1毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；HEPENGBIO底物液A（Reagent B）含有毒性物质和HEPENGBIO终止液（Reagent G）具有腐蚀性，注意操作安全；HEPENGBIO反应液A（Reagent C1）和HEPENGBIO底物液B（Reagent F），避免光照；3月
用户自备
恒温培养箱或恒温水槽：用于反应物孵育
200微升1厘米光径比色皿：用于比色测定的容器
分光光度仪：用于比色分析
实验步骤
1、琥珀酸脱氢酶活性检测
一、测定准备
1． 准备好待测样品，置于冰槽里
2． 设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长600nm，并置零
3． HEPENGBIO缓冲液A（Reagent A）室温下均衡温度
4． 将－20℃冰箱里试剂盒中的HEPENGBIO反应液A（ReagentC1）置于室温下均衡温度，然后加入1毫升HEPENGBIO反应液B（Reagent C2），使其充分溶解，标记为HEPENGBIO反应工作液，置于冰槽里备用。
二、 背景对照测定
1． 移取195微升HEPENGBIO缓冲液A（Reagent A）到新的比色皿
2． 加入10微升HEPENGBIO底物液A（Reagent B）
3． 加入25微升HEPENGBIO反应工作液
4． 上下倾倒数次，混匀
5． 放进37℃培养箱里静置3分钟
6． 加入20微升HEPENGBIO阴性液（Reagent D）
7． 即刻放进分光光度仪检测：获得0分钟和5分钟吸光读数
8． 背景对照实际读数：OD0分钟－OD5分钟
三、 样品活性测定
1． 移取195微升HEPENGBIO缓冲液A（Reagent A）到新的比色皿
2． 加入10微升HEPENGBIO底物液A（Reagent B）
3． 加入25微升HEPENGBIO反应工作液
4． 上下倾倒数次，混匀
5． 放进37℃培养箱里静置3分钟
6． 加入20微升待测样品（注意：10微克总线粒体蛋白；样品须溶解）
7． 即刻放进分光光度仪检测：获得0分钟和5分钟吸光读数
8． 样品实际读数：OD0分钟－OD5分钟
四、 计算样品活性
[（样品读数－背景读数）X 0.25（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.02（样品容量；毫升）X 21（毫摩尔吸光系数）X 5（反应时间；分钟）]＝单位/毫升
转换：单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔DCIP还原/分钟
2、酸性磷酸酶活性检测
一、 测定准备
1． 准备好上述待测样品，置于冰槽里
2． 设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长410nm，并置零
3． HEPENGBIO缓冲液B（Reagent E）室温下均衡温度
二、 背景对照测定
1． 移取160微升HEPENGBIO缓冲液B（Reagent E）到新的比色皿
2． 加入20微升HEPENGBIO阴性液（Reagent D）
3． 加入20微升HEPENGBIO底物液B（Reagent F）
4． 上下倾倒数次，混匀
5． 放进37℃恒温培养箱孵育5分钟，避免光照
6． 加入50微升HEPENGBIO终止液（Reagent G），混匀
7． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照读数
三、 样品活性测定
1． 移取160微升HEPENGBIO缓冲液B（Reagent E）到新的比色皿
2． 加入20微升待测样品（总量10微克线粒体蛋白）
3． 加入20微升HEPENGBIO底物液B（Reagent F）
4． 上下倾倒数次，混匀
5． 放进37℃恒温培养箱孵育5分钟，避免光照
6． 加入50微升HEPENGBIO终止液（Reagent G），混匀
7． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数
四、 计算样品活性
[（样品读数－背景读数）X 0.25（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.02（样品容量；毫升）X 18.3（毫摩尔吸光系数）X 5（反应时间；分钟）]＝单位/毫升
转换：单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔对硝基苯酚/分钟
注意事项
1． 本产品为20次操作，
2． 操作时，须戴手套
3． HEPENGBIO反应液A（Reagent C1）含有毒性物质，避免直接用手接触
4． HEPENGBIO终止液（Reagent G）具有腐蚀性，注意操作安全
5． 线粒体样品检测前，须溶解；建议冻存融解（－70℃至37℃）循环3次或使用HEPENGBIO线粒体溶解试剂盒
6． 比色测定后，比色皿须清洗
7． 建议待测样本线粒体蛋白浓度为10微克/20微升 （本公司提供HEPENGBIO线粒体溶解试剂盒为后续的线粒体蛋白浓度测定的预处理试剂盒和HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒）
8． 琥珀酸脱氢酶活性越高，线粒体纯度越高；酸性磷酸酶活性越高，线粒体纯度越低
9． 通常琥珀酸脱氢酶与酸性磷酸酶的比活性之比约在4：0.5；纯度为87.5%
10． 本公司提供系列线粒体及其相关酶类技术产品
本产品仅供科研使用,请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
