企业档案
会员类型：标准版
已获得阿仪网信誉 等级评定
(0 -40)基础信誉积累，可浏览访问
(41-90)良好信誉积累，可接洽商谈
(91+ )优质信誉积累，可持续信赖
阿仪网标准版会员：11年
工商认证 【已认证】
最后认证时间：
注册号： 【已认证】
法人代表： 【已认证】
参观次数：4594575
技术文章
HEPENGBIO细胞P300/CBP组蛋白乙酰转移酶（P300/CBP-HAT）活性光度法定量检测试剂盒@说明书
点击次数：2665 发布时间：2024/7/18 11:20:41
HEPENGBIO细胞P300/CBP组蛋白乙酰转移酶（P300/CBP-HAT）活性光度法定量检测
试剂盒说明书
主要用途
HEPENGBIO细胞P300/CBP组蛋白乙酰转移酶（P300/CBP-HAT）活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过通用底物H3多肽，在敏感性抑制剂存在与否的情况下，通过P300/CBP的作用，将乙酰辅酶A上的乙酰基团，转移到多肽分子上的过程中，释放出巯基辅酶A，进而与Ellman试剂反应，产生黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物吸光峰值的变化，即采用光度法来测定细胞裂解萃取样品中酶活性的方法。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、核蛋白样品、部分或完全纯化酶样品中P300/CBPHAT的特异活性检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景
核小体（nucleosome）是染色质的最小结构单位，由组蛋白H2A-H2B双体和H3-H4双体构成的组蛋白八体结构（octamer），外层涵盖146碱基DNA。其结构中组蛋白N末端为游离状态，且高度进化保留，在特定氨基酸部位发生诸如甲基化、乙酰化、磷酸化修饰，以改变其电荷和功能。组蛋白上特定赖氨酸残基的ε氨基基团的乙酰化通过组蛋白乙酰转移酶（Histone Acetyltransferase；HAT；EC2.3.1.48）催化产生，具有表观遗传学的调节作用，达到染色体重构（remodeling），染色质松弛打开，促使基因转录。其功能异常将导致肿瘤、神经退行性疾病、AIDS和炎症。组蛋白乙酰转移酶，又称为赖氨酸乙酰转移酶（lysine acetyltransferase）；KAT），分成二型，细胞核内的A型，包括P300/CBP、Gcn5、TAFII250等，和细胞浆内的B型，例如Hat1。其又分成六类：P300/CBP（P300/cAMP Responsive Element-Binding Protein），包括P300、CBP等；GNAT（Gcn5-related N-acetyltransferase），包括Gcn5、PCAF、Hat1、Elp3、Hpa2、Hpa3、ATF-2、Nut1等；MYST（MOZ、ybf2/sas3、sas2、Tip60），还包括Esa1、MOF、MORF、HBO1等；核受体共激活因子（nuclear receptor co-activator），包括SRC-1、SRC-3、ACTR、TIF2；TAFII250（TATA box binding protein associated factor）；TFIIIC（tranｓcriptional factor IIIC）等。其中P300/CBP家属中包括P300、CBP、和P300/CBP相关因子（P300/CBP Associated Factor；PCAF），这是第个发现的组蛋白乙酰转移酶，成为结构、机制和功能研究的代表。P300（又称为KAT3B），E1A肿瘤结合蛋白和CBP（又称为KAT3A），cAMP反应元素结合蛋白（cAMP Responsive Element-Binding Protein；CREB）是面性转录共激活因子（globaltranｓcription coactivator），位于核内，属于旁系同源（paralogue）蛋白，功能相等，序列相似，相同的结构域（包括核受体结合结构域、锌指（zinc finger）结构域、溴区结构域（bromodomain）、内部大乙酰转移酶结构域等），具有内生性乙酰转移酶活性，乙酰化组蛋白和非组蛋白，与300多个DNA结合性转录因子、病毒转化因子、核受体、信号分子等反应、其功能在于调节细胞周期和细胞分化、控制细胞生长和凋亡、整合多种转录水平信号依赖性通路（例如G蛋白通路）、修正基因表达、DNA修复和复制、蛋白间反应和蛋白稳定性，作用于胚胎发育尤其是器官生成，以及调节造血干细胞、神经突触活性和期记忆形成等。P300和CBP异常，会导致肿瘤发生和发展、糖尿病、哮喘、髓细胞白血病（myeloid cell leukemia）、阔拇指巨趾综合征（Rubinstein-Taybi syndrome）。基于底物H3组蛋白多肽Ac-Gln-Thr-Ala-Arg-Lys-Ser-Thr-Gly-Gly-Lys-Ala- Pro-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-Thr- Lys-NH2 （H3组蛋白N末端5至23氨基酸残基），在P300/CBP敏感性抑制剂C646存在与否的情况下，通过P300/CBP的作用，将乙酰辅酶A上的乙酰基团，转移到多肽分子上，由此产生乙酰化多肽和巯基辅酶A（CoA-SH），与Ellman试剂5，5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）[5，5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反应后，产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通过其吸收峰值的变化（412nm波长），来定量测定P300/CBP组蛋白乙酰转移酶的特异活性。其反应系统为：
P300/CBP HAT
Histone H3 peptide + acetyl Co-A → Ac(Lys)-Histone H3 peptide + CoA-SH
C646
DTNB + CoA-SH → TNB+ CoA-S-S-TNB
产品内容
HEPENGBIO裂解液（Reagent A） 20毫升
HEPENGBIO分离液（Reagent B） 80毫升
HEPENGBIO清理液（Reagent C） 80毫升
HEPENGBIO萃取液（Reagent D） 5毫升
HEPENGBIO缓冲液（Reagent E） 12毫升
HEPENGBIO反应液（Reagent F） 200微升
HEPENGBIO底物液（Reagent G） 1.6毫升
HEPENGBIO显色液（Reagent H） 3毫升
HEPENGBIO专性液（Reagent I） 100微升
产品说明书 1份
保存方式
保存HEPENGBIO反应液（Reagent F）、HEPENGBIO底物液（ReagentG）、HEPENGBIO显色液（Reagent H）和HEPENGBIO专性液（Reagent I）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO显色液（Reagent H）避免光照，保证6月
用户自备
磷酸盐缓冲溶液（PBS）：用于清洗细胞样品
15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器
1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器
细胞刮脱棒：用于细胞脱离
（微型）台式离心机：用于细胞预处理
96孔板或200微升1厘米光径比色皿：用于反应和光度分析的容器
酶标仪或分光光度仪：用于光度分析
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。
一、样品准备
1． 准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 107细胞）
2． 小心抽去培养液
3． 小心加入10毫升用户自备的磷酸盐缓冲溶液（PBS），覆盖生长表面
4． 小心抽去清理液
5． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
6． 加入1毫升HEPENGBIO裂解液（Reagent A），混匀细胞
7． 移入到预冷的15毫升锥形离心管
8． 强力涡旋震荡10秒
9． 置于冰槽里孵育15分钟
10． 加入4毫升预冷的HEPENGBIO分离液（Reagent B），混匀
11． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1300g
12． 小心抽去上清液
13． 加入4毫升预冷的HEPENGBIO清理液（Reagent C）
14． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1300g
15． 小心抽去上清液
16． 小心加入100微升预冷的HEPENGBIO萃取液（Reagent D），混匀
17． 转移到新的预冷的1.5毫升离心管
18． 超声处理30秒：功率100瓦，10秒一次，间隔2分钟，重复2次（注意：保持在冰槽里）
19． 置于冰槽里孵育30分钟
20． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF 5415）
21． 小心移取上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
22． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒）
23． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、 测定准备
1． 准备好待测样品（例如核蛋白或纯化酶样品等），置于冰槽里
2． 开启并设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长412nm，间隔5分钟，读数3次（共15分钟），并置零
3． HEPENGBIO缓冲液（ReagentE）室温下均衡温度
三、 样品总活性测定
1． 标记好样本背景和样本活性管（孔）
2． 分别移取15微升HEPENGBIO缓冲液（ReagentE）到新的比色皿或96孔板
3． 加入5微升HEPENGBIO缓冲液（ReagentE）到样本背景管（孔）
4． 加入5微升HEPENGBIO反应液（ReagentF）到样本活性管（孔）
5． 分别加入20微升HEPENGBIO底物液（ReagentG）到所有管（孔）
6． 加入50微升HEPENGBIO显色液（ReagentH）
7． 分别加入10微升待测样品（注意：50微克核蛋白；样品须清澈）到所有管（孔）
8． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
9． 即刻放进分光光度仪检测，获得样品背景和样品总活性读数（15分钟读数－0分钟读数）
四、 样品非特异活性测定
1． 标记好样本非特异活性管（孔）
2． 移取10微升HEPENGBIO缓冲液（ReagentE）到新的比色皿或96孔板
3． 加入5微升HEPENGBIO反应液（ReagentF）
4． 加入20微升HEPENGBIO底物液（ReagentG）
5． 加入5微升HEPENGBIO专性液（ReagentI）
6． 加入50微升HEPENGBIO显色液（ReagentH）
7． 加入10微升待测样品（注意：50微克核蛋白；样品须清澈）
8． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
9． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数（15分钟读数－0分钟读数）
五、 计算样品实际活性
1） 总活性和非特异活性
[（样品读数－背景读数）X 0.1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.01（样品容量；毫升）X 13.6（毫摩尔吸光系数）X 15（分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔辅酶A /分钟
2） 样品特异活性
总活性—非特异活性
注意事项
1． 本产品为20次操作，包括平行背景对照
2． 操作时，须戴手套
3． 样品须澄清，至关重要
4． 样品处理时，避免使用巯基乙醇、DTT等
5． 加样后3秒内光度测定
6． 测定值由低到高变化
7． 测定值吸光读数越高，表明酶活性越高
8． 光度测定后，比色皿须清洗底
9． 待测样本为核蛋白样品，其蛋白浓度为50微克/10微升（本公司提供HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒）
10． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
11． P300/CBP组蛋白乙酰转移酶单位活性定义为：在25℃，pH7.5条件下，每分钟内能够释放1纳摩尔巯基辅酶A所需的酶量作为一个活性单位
12． 本公司提供系列组蛋白乙酰转移酶检测试剂产品
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
