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技术文章
HEPENGBIO RNA荧光（RiboGreen）定量检测试剂盒产品说明书@分析方法
点击次数：2718 发布时间：2024/7/18 11:19:16
HEPENGBIO RNA荧光（RiboGreen）定量检测试剂盒产品说明书
主要用途
HEPENGBIO RNA荧光（RiboGreen）定量检测试剂是一种旨在通过使用RiboGreen荧光染料与样品中RNA的高度结合而产生荧光信号来精确定量样品中RNA含量的技术方法。其适用于各种分子生物学实验，例如体外转录RNA、Northern Bolt、S1核酸酶检测、RNA酶保护检测、cDNA库制备、逆转录PCR和差异显示PCR中RNA含量分析。产品严格无菌，即到即用，性能稳定，高度敏感。
技术背景
作为RNA染色剂之一的RiboGreen荧光染料,为不对称性青色素染料（unsymmetrical cyanine dye），与样品中RNA，包括rRNA、mRNA等结合，产生荧光信号。RiboGreen技术可以检测到低达1纳克RNA的变化。RNA的微量增加引起荧光信号强度（Intensity）或相对荧光单位（RFU）的显著增加。其自发荧光（Autofluorescence）忽略不计，重复性标准差异（Standard Deviation）低，不受样品化学成分的干扰。
产品内容
HEPENGBIO染色液（Reagent A） 15微升
HEPENGBIO稀释液（Reagent B） 5毫升
HEPENGBIO标准液（Reagent C） 200微升
产品说明书 1份
保存方式
保存HEPENGBIO染色液（Reagent A）和HEPENGBIO标准液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里，HEPENGBIO染色液（Reagent A）避免光照，保证6月
用户自备
1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
200微升1厘米光径比色皿或黑色96孔板：用于荧光分析的容器
荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光定量分析
实验步骤
一、 测定准备
1． 准备好待测样品，置于冰槽里
2． 设定好荧光分光光度仪：激发波长485±10nm，散发波长530±12.5nm，并置零；增益倍数100
3． 实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的HEPENGBIO染色液（Reagent A）置于冰槽里融化。然后移出500微升HEPENGBIO稀释液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入2.5微升HEPENGBIO染色液（Reagent A），混匀后，用锡纸包裹，标记为HEPENGBIO染色工作液（5次测定量），放在暗室里。然后进行下列操作。
二、 构建标准曲线
1． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
2． 分别加入100微升HEPENGBIO稀释液（Reagent B）到每个离心管
3． 移取100微升HEPENGBIO标准液（Reagent C）到1号管，混匀
4． 小心移取100微升1号管稀释的HEPENGBIO标准液（Reagent C）到2号管，混匀
5． 小心移取100微升2号管稀释的HEPENGBIO标准液（Reagent C）到3号管，混匀
6． 小心移取100微升3号管稀释的HEPENGBIO标准液（Reagent C）到4号管，混匀
7． 将1至5号管放进冰槽里备用；标准管含量见下表
管号 | HEPENGBIO稀释液（Reagent B） | HEPENGBIO标准液（Reagent C） | 标准RNA总量 |
1 | 100微升 | 100微升 | 1微克/毫升 |
2 | 100微升 | 100微升1号管 | 0.5微克/毫升 |
3 | 100微升 | 100微升2号管 | 0.25微克/毫升 |
4 | 100微升 | 100微升3号管 | 0.125微克/毫升 |
5 | 100微升 | 空对照 | 0 |
8． 移取100微升含有HEPENGBIO染色液（Reagent A）和HEPENGBIO稀释液（Reagent B）的HEPENGBIO染色工作液到新的比色皿
9． 加入100微升上述配制的标准液
10． 室温下，孵育5分钟，避免光照
11． 即刻放进荧光分光光度仪测读：获得相对荧光单位（Relative Fluorescence Unit；RFU）
12． 重复实验步骤8至11四次
13． 绘制标准曲线：纵座标（Y轴）为相对荧光单位（RLU）；横坐标（X轴）为DNA含量（微克/毫升）
三、 样品检测
1． 移取100微升含有HEPENGBIO染色液（Reagent A）和HEPENGBIO稀释液（Reagent B）的HEPENGBIO染色工作液到新的比色皿
2． 加入100微升待测样品
3． 室温下，孵育5分钟，避免光照
4． 即刻放进荧光分光光度仪测读：获得相对荧光单位（Relative Fluorescence Unit；RFU）
5． 根据标准曲线获得样品对应RNA含量（微克/毫升）
注意事项
1． 本产品为25次操作，包括标准曲线测定
2． 整个操作须带手套，建议使用滤芯枪头，并格外小心，防止降解RNA
3． 建议所有的操作用品属于RNA专用
4． 使用新鲜配制的HEPENGBIO染色工作液，务必不要超过2小时，且注意避光
5． 孵育时，避免光照
6． 系统检测，标准曲线测定1次即可；如果仪器更换，则需要重新测定1次
7． 如果荧光读数过高，可以相应稀释样品量
8． 盐类、尿素、乙醇、、去垢剂、蛋白、琼脂糖不会干扰检测
9． 如果样品中含有DNA，建议使用5单位DNA酶，37℃孵育90分钟预处理
10． 标准曲线参考如下：
11． 本公司提供系列RNA检测试剂产品
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
