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技术文章
HEPENGBIO细胞AMPK激酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书技术背景
点击次数：2675 发布时间：2024/7/18 11:08:48
HEPENGBIO细胞AMPK激酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书
主要用途
HEPENGBIO细胞AMPK激酶活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物受到AMPK磷酸化后，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光度法测定其氧化后峰值的变化，以分析细胞裂解样品中AMPK活性的方法。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或完全纯化酶样品中AMPK激酶的定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。
技术背景
5’AMP活化蛋白激酶（5’AMP activated protein kinase；AMPK）属于丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家属成员之一。其为从酵母到人体高度进化保留的激酶复合物，由3个亚体，α、β、γ构成：其中γ亚体有4个胱硫醚β合酶（cystathione beta synthase；CBS）结构域，又称为巴特曼（Bateman）结构域，以探测AMP和ATP的比例；α亚体含有催化结构域，一旦收到AMPKK或LKB1/MO25/STRAD复合物催化的磷酸化后，AMPK被激活。所有亚体都有不同异构体形式，包括α1、α2、β1、β2、γ1、γ2和γ3。其功能在于保持细胞能量内环境恒定：促进脂肪酸β氧化、抑制胆固醇合成、促进肌肉葡萄糖吸收和调节胰岛素分泌等。AMPK在肝脏、脑和肌肉组织中高度表达。其磷酸化目标序列为 LKKLTRASFFGQ。基于底物LKKLTRASFFGQ，在ATP的存在下，受到5’AMP活化蛋白激酶的磷酸化，获得产物磷酸化多肽，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析5’AMP活化蛋白激酶的活性。其反应方式为：
AMPK
LKKLTRASFFGQ + ATP → LKKLTRApSFFGQ + ADP
pyruvate kinase
Phosphoenolpyruvate + ADP → pyruvate + ATP
lactate dehydrogenase
pyruvate + NADH → lactate + NAD+
（高吸收峰）（低吸收峰）
产品内容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 120毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 10毫升
HEPENGBIO缓冲液（Reagent C） 4毫升
HEPENGBIO酶促液（Reagent D） 500微升
HEPENGBIO反应液（Reagent E） 500微升
HEPENGBIO底物液（Reagent F） 500微升
HEPENGBIO阴性液（Reagent G） 500微升
保存方式
保存HEPENGBIO清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；保证6月
用户自备
AMPK激酶：用于抑制剂筛选
1.5毫升离心管：用于样品保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器
细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离
（微型）台式离心机：用于细胞预处理
200微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器
分光光度仪或酶标仪：用于样品光度分析
实验步骤
一、 待测样品准备
1． 准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 107细胞）
2． 小心加入3毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
5． 加入3毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），混匀细胞
6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入100至500微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B），充分混匀（注意：可以调节蛋白浓度）
10． 转移到预冷的1.5毫升离心管
11． 强力涡旋震荡15秒
12． 置于冰槽里孵育30分钟
13． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14． 小心移取100至500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒）
16． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、 测定准备
1． 准备好待测样品（例如细胞裂解悬液等），置于冰槽里
2． 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零
3． HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度
三、 背景对照测定
1． 移取130微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入20微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
3． 加入20微升HEPENGBIO反应液（Reagent E）
4． 加入20微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
5． 放进30℃培养箱里静置3分钟
6． 加入10微升HEPENGBIO阴性液（Reagent G）
7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟－340波长读数5分钟
四、 样品测定
1． 移取130微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入20微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
3． 加入20微升HEPENGBIO反应液（Reagent E）
4． 加入20微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
5． 放进30℃培养箱里静置3分钟
6． 加入10微升待测样品（注意：100微克细胞裂解蛋白；样品须澄清）
7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟－340波长读数5分钟
五、 计算样品活性
[（样品读数－背景读数）X 0.2（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.010（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 5（反应时间；分钟）]＝单位/毫升
转换：单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔NADH/分钟
六、 酶标仪测定
1． 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
2． 分别移取130微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到96孔板里
3． 分别加入20微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
4． 分别加入20微升HEPENGBIO反应液（Reagent E）
5． 分别加入20微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
6． 轻轻摇动96孔板
7． 在30℃温度下孵育3分钟
8． 分别加入10微升HEPENGBIO阴性液（Reagent G）或待测样品（100微克细胞裂解悬液蛋白）到相应孔里（注意：样品须澄清）
9． 轻轻摇动96孔板
10． 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
11． 活性计算：
[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.2（体系容量；毫升）]÷[0.010（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 0.5（光径距离；厘米）X 5（反应时间；分钟）]＝单位/毫升
转换：单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔NADH/分钟
七、抑制剂筛选
1． 在96孔板上做好相应标记：背景、完全活性和待测抑制剂样品
2． 按下表加入试剂，进行样品预处理
内容物 | 空背景对照 | 样本背景 | 完全酶活性 | 待测抑制剂酶活性 |
HEPENGBIO缓冲液（Reagent C） | 20微升 | 20微升 | 20微升 | 20微升 |
HEPENGBIO阴性液（Reagent G） | 20微升 | 10微升 | 10微升 | —— |
待测抑制剂 | —— | 10微升 | ―― | 10微升 |
用户自备的纯化酶 | —— | —— | 10微升（1毫单位） | 10微升（1毫单位） |
96孔板每孔总量 | 空背景对照孔 （40微升） | 样本背景孔 （40微升） | 完全活性孔 （40微升） | 待测抑制剂样品孔 （40微升） |
轻轻摇动96孔板，混匀，放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后进行下列操作 | ||||
3． 分别移取100微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
4． 分别加入20微升HEPENGBIO酶促液（Reagent D）
5． 分别加入20微升HEPENGBIO反应液（Reagent E）
6． 分别加入20微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
7． 轻轻摇动96孔板
8． 在30℃温度下孵育3分钟
9． 加入40微升上述预处理的待测样品
10． 即刻放进30℃酶标仪检测：测读0分钟和30分钟
11． 实际读数：0分钟读数—30分钟读数
12． 抑制活性计算：
1) [（完全活性读数－空背景对照读数）－（抑制剂样品活性读数－样本背景读数）]÷（完全活性读数－空背景对照读数）＝实际抑制百分率
2) IC50：50％抑制率所需的抑制剂浓度
X（所需抑制剂样品浓度）＝（已知抑制剂样品浓度÷实际抑制百分率）X 50％
i. 直接构建抑制曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位（OD）；横座标（X轴）为已知抑制剂浓度
注意事项
1． 本产品为25次操作，包括背景操作
2． 操作时，须戴手套
3． 系统操作过程中，背景测定只需1次
4． 样品处理忌用磷酸缓冲溶液
5． 样品须澄清，至关重要
6． 建议使用比色皿测定
7． 加入样品启动反应后3秒内即刻光度测定
8． 测定值由高到低变化；测定可持续30分钟
9． 光度测定后，比色皿须清洗
10． 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性
11． 样本测定读数持续上升，表明酶活过低或样品量过低
12． 建议待测样本蛋白浓度为100微克/10微升（本公司提供HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒）
13． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
14． 可以使用AMPK抑制剂（DORSOMORPHIN）作为抑制剂对照或阴性对照
15． 5’AMP活化蛋白激酶活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
16． 本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品
本产品仅供科研使用,请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
