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技术文章
HEPENGBIO石蜡切片脂质过氧化物4-羟基壬烯醛（4－HNE）荧光染色试剂盒实验几个优点你知道吗？
点击次数：2780 发布时间：2024/7/18 11:03:24
HEPENGBIO石蜡切片脂质过氧化物4-羟基壬烯醛（4－HNE）荧光染色试剂盒
产品说明书
主要用途
HEPENGBIO石蜡切片脂质过氧化物4-羟基壬烯醛（4－HNE）荧光染色试剂是一种旨在使用标准化的化学分离石蜡方法和单克隆抗4-羟基壬烯醛抗体以及荧光染料缀合物二抗的应用，通过荧光显微镜分析存档中的石蜡包埋的组织切片中4-羟基壬烯醛的分布状态，从而观察分析脂质过氧化的方法。主要适用于各种动物和人体组织石蜡包埋切片的4-羟基壬烯醛分析。产品严格无菌，即到即用，反应敏感，操作简捷，性能稳定，荧光清晰。
技术背景
脂质过氧化（lipid peroxidation）是脂类分子的氧化性修饰，由体外过氧化物因子诱导产生，或衰老和疾病状态时体内出现，造成植物和动物细胞损伤。脂类过氧化物（lipid peroxide）为不稳定产物，非酶促反应而分解继发产生天然的复杂活性醛类副产品复合物，例如丙二醛（malondialdehyde；MDA）、（acrolein）和4-羟基壬烯醛（4-hydroxy-2-nonenal；4－HNE），来自于ω-6多饱和脂肪酸花生四烯酸或多不饱和膜类脂质（磷脂）的氧化，与蛋白质结合，形成稳定的加合物，后期脂质过氧化终端产物，导致氧化性蛋白结构和功能损伤，进而产生细胞毒性、生长抑制、遗传毒性、趋化活性，通过改变巯基抑制SIRT3和改变基因表达。其中脂类氧化损伤产物4-羟基壬烯醛，为9碳两性脂质醛，亲电子性（electrophilic），通过与各种生物分子的巯基或氨基反应，包括磷脂、蛋白、核酸等，形成二价加合物，参与代谢性疾病，例如糖尿病、肥胖症等病理变化。4-羟基壬烯醛是细胞氧化应激的分子标志。通过单克隆抗4-羟基壬烯醛抗体以及荧光染料缀合物二抗的应用，在荧光显微镜下分析存档中的石蜡包埋的组织切片中4-羟基壬烯醛的绿色荧光分布状态，从而观察分析脂质过氧化。
产品内容
HEPENGBIO脱蜡液（Reagent A） 150毫升（自备）
HEPENGBIO补水液A（Reagent B） 50毫升
HEPENGBIO补水液B（Reagent C） 50毫升
HEPENGBIO补水液C（Reagent D） 50毫升
HEPENGBIO补水液D（Reagent E） 50毫升
HEPENGBIO清理液（Reagent F） 20毫升
HEPENGBIO修复液（Reagent G） 2毫升
HEPENGBIO封阻液（Reagent H） 2毫升
HEPENGBIO抗体液（Reagent I） 1毫升
HEPENGBIO染色液（Reagent J） 1毫升
HEPENGBIO强化液（Reagent K） 100毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存HEPENGBIO修复液（Reagent G）、HEPENGBIO封阻液（Reagent H）、HEPENGBIO抗体液（Reagent I）和HEPENGBIO染色液（Reagent J）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO抗体液（Reagent I）和HEPENGBIO染色液（Reagent J）严禁反复冻融； HEPENGBIO染色液（Reagent J）避免光照；6月
用户自备
盖玻片：用于封片孵育
小型染色缸：用于脱蜡的操作
烘箱：用于脱蜡处理
（共聚焦）荧光显微镜：用于组织细胞荧光观察
实验步骤
一、 脱蜡处理
1． 取出10片待测的10微米厚的石蜡包埋的组织切片
2． （选择步骤）放进80℃烘箱，孵育30分钟
3． （选择步骤）室温下静置15分钟
4． 按下表依次放进小染色缸里孵育
染色缸 | 孵育时间 |
50毫升HEPENGBIO脱蜡液（Reagent A） | 15分钟 |
50毫升HEPENGBIO脱蜡液（Reagent A） | 15分钟 |
50毫升HEPENGBIO脱蜡液（Reagent A） | 15分钟 |
50毫升HEPENGBIO补水液A（Reagent B） | 3分钟 |
50毫升HEPENGBIO补水液B（Reagent C） | 3分钟 |
50毫升HEPENGBIO补水液C（Reagent D） | 3分钟 |
50毫升HEPENGBIO补水液D（Reagent E） | 3分钟 |
5． 小心移去切片上的HEPENGBIO补水液D（Reagent E）
6． 小心加上200微升HEPENGBIO清理液（Reagent F）在切片上，铺满整个切片样品表面
7． 室温下孵育5分钟
8． 小心移去切片上的HEPENGBIO清理液（Reagent F）
二、样品预处理
实验开始前，将－20℃冰箱里试剂盒中的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作：
1． （选择步骤）将切片置于100毫升烧杯，加入50毫升HEPENGBIO强化液（Reagent K）
2． （选择步骤）放进微波炉里加热5分钟：其中15秒煮沸后，间隙15秒后再煮沸，直至5分钟
3． （选择步骤）室温下，冷却20分钟
4． 加入200微升HEPENGBIO修复液（Reagent G）在切片上，铺满整个切片样品表面
5． 室温下孵育5分钟
6． 小心抽去HEPENGBIO修复液（Reagent G）
7． 空气中晾干
8． 加入200微升HEPENGBIO清理液（Reagent F）在切片上，铺满整个切片样品表面
9． 室温下孵育5分钟
10． 小心抽去HEPENGBIO清理液（Reagent F）
11． 加入200微升HEPENGBIO封阻液（Reagent H）在切片上，铺满整个切片样品表面
12． 室温下孵育60分钟
13． 小心抽去HEPENGBIO封阻液（Reagent H）
三、 样品染色处理
1． 加入100微升HEPENGBIO抗体液（Reagent I）在切片上，铺满整个切片样品表面
2． 盖上盖玻片，室温下孵育1小时（注意：避免气泡；参见注意事项9）
3． 小心移去盖玻片，抽去HEPENGBIO抗体液（Reagent I）
4． 加入200微升HEPENGBIO清理液（Reagent F）在切片上，铺满整个切片样品表面
5． 室温下孵育5分钟
6． 小心抽去HEPENGBIO清理液（Reagent F）
7． 重复实验步4至6二次
8． 加入100微升HEPENGBIO染色液（Reagent J）在切片上，铺满整个切片样品表面
9． 室温下孵育30分钟，避免光照（注意：避免气泡）
10． 小心抽去HEPENGBIO染色液（Reagent J）
11． 加入200微升HEPENGBIO清理液（Reagent F）在切片上，铺满整个切片样品表面
12． 室温下孵育5分钟
13． 小心抽去HEPENGBIO清理液（Reagent F）
14． 重复实验步11至13二次
15． 盖上盖玻片或封片
16． 即刻在（共聚焦）荧光显微镜下观察：激发波长488nm。散发波长530nm—脂质过氧化物4-羟基壬烯醛阳性的细胞呈现绿色荧光
注意事项
1． 本产品为10次操作
2． 操作时须戴手套，以防污染
3． 石蜡包埋前，组织切片须用10％甲醛4℃条件下，固定16小时，否则造成样品支离破碎
4． 所有操作在室温下进行
5． 用户可以使用二甲苯替代HEPENGBIO脱蜡液（Reagent A）
6． 每次更换试剂溶液时，保持切片面基本晾干。空气中晾干状态为没有水滴，呈湿润状态，可见反光
7． 试剂溶液在切片表面时，避免有气泡存在，同时确保铺满切片表面
8． 染色孵育时，须避免光照
9． HEPENGBIO抗体液（Reagent I）孵育，可以持续16小时
10． 建议染色完成后，即刻进行荧光显微镜观察
11． 本公司提供系列脂质过氧化检测试剂产品
本产品仅供科研使用,请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
