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技术文章
HEPENGBIO细胞总抗氧化能力（TAC）荧光法（ORAC）定量检测试剂盒实验步骤参考说明书
点击次数：2670 发布时间：2024/7/18 11:00:06
HEPENGBIO细胞总抗氧化能力（TAC）荧光法（ORAC）定量检测试剂盒
产品说明书
主要用途
HEPENGBIO细胞总抗氧化能力（TAC）荧光法（ORAC）定量检测试剂是一种旨在通过使用荧光素探针，受到过氧自由基AAPH的破坏，但在抗氧化剂的存在下，得到抑制，由此通过荧光分光光度仪，观察其峰值下降程度的变化，来定量检测对应于标准水溶性生育酚Trolox的总抗氧化能力，即消除自由基等值浓度的方法。适用于各种新鲜细胞样品总抗氧化能力检测。产品严格无菌，即到即用，操作简易，性能稳定。
技术背景
超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hyｄroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxylradical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitriteanion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinoneradical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡，甚而导致诸如冠心病、风湿性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。在生物系统内，通过抗氧化酶例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等，大分子，例如白蛋白、铜蓝蛋白（ceruloplasmin；CER）、铁蛋白（ferritin）和抗氧化因子，例如生育醇、类胡萝卜素、抗坏血酸、还原性谷胱甘肽和尿酸胆红素（bilirubin）等，产生抗氧化能力，即捕获自由基的能力，达到消除或降低ROS的损害。通过氧自由基吸光能力（oxygen radical absorbance capacity；ORAC），即使用荧光素（fluorescein）作为探针，2,2'-偶氮二异丁基脒二酸盐（2,2-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride；AAPH）作为过氧自由基供体（peroxyl radical donor），其攻击探针，产生荧光淬灭，一旦受到抗氧化剂作用，而防止荧光消失，由此评价抗氧化潜力和活性，也就是自由基去除作用（free radical scavenging），在荧光分光光度仪（激发波长485nm±20，散发波长528nm±20）的帮助下，观察其峰值下降程度的变化，并与标准化抗氧化剂水溶性生育酚Trolox对照。
产品内容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 300毫升
HEPENGBIO低渗液（Reagent B） 25毫升
HEPENGBIO缓冲液（ReagentC） 4毫升
HEPENGBIO染色液（ReagentD） 7.5毫升
HEPENGBIO氧化液（ReagentE） 1管
HEPENGBIO标准液（ReagentF） 200微升
产品说明书 1份
保存方式
保存HEPENGBIO清理液（Reagent A）、HEPENGBIO低渗液（Reagent B）和HEPENGBIO缓冲液（ReagentC）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免光照；保证6月
用户自备
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
1.5毫升离心管：用于标准样品配制的容器
4℃（微型）台式离心机：用于样品操作
细胞刮脱棒：用于脱离细胞
超声仪：用于破碎细胞
200微升1厘米光径比色皿或黑色96孔板：用于荧光分析的容器
荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光分析
实验步骤
一、 样品准备
1． 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 106细胞）
2． 小心加入3毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
5． 加入2毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），混匀细胞
6． 移入到预冷的2毫升离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入500微升HEPENGBIO低渗液（Reagent B），混匀
10． 置于200瓦超声仪枪头下，离心管在冰槽里
11． 超声功率为100％，猝击10秒，2个循环
12． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415）
13． 移取上清液到新的4℃预冷的1.5毫升离心管
14． 移取10微升进行蛋白定量检测（建议使用HEPENGBIO BCA蛋白质浓度定量试剂盒）
15． 使用HEPENGBIO清理液（Reagent A）调整蛋白浓度为100微克/25微升
16． 置于冰槽里待测
二、标准液准备
1． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
2． 分别加入50微升HEPENGBIO缓冲液（ReagentC）到2至5号管
3． 移取100微升HEPENGBIO标准液（ReagentF）到1号管，混匀
4． 小心移取50微升1号管的HEPENGBIO标准液（ReagentF）到2号管，混匀
5． 小心移取50微升2号管稀释的HEPENGBIO标准液（ReagentF）到3号管，混匀
6． 小心移取50微升3号管稀释的HEPENGBIO标准液（ReagentF）到4号管，混匀
7． 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表
管号 | HEPENGBIO缓冲液（ReagentC） | HEPENGBIO标准液（ReagentF） | 测定体系 标准 Trolox浓度 |
1 | 0 | 100微升 | 1微摩尔/升 |
2 | 50微升 | 50微升 | 0.5微摩尔/升 |
3 | 50微升 | 50微升 | 0.25微摩尔/升 |
4 | 50微升 | 50微升 | 0.125微摩尔/升 |
5 | 50微升 | 0 | 0 |
三、 样品测读
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置于室温下融化，移取1.5毫升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到1管HEPENGBIO氧化液（Reagent E）里，混匀，置于暗室里，标记为HEPENGBIO氧化工作液，避免光照。然后进行下列操作。
1． 准备1个黑色96孔板，做好标记：最大对照孔、标准样品孔、待测样品孔
2． 分别移取150微升HEPENGBIO染色液（ReagentD）到黑色96孔板里的每个孔里
3． 加入25微升HEPENGBIO缓冲液（ReagentC）到最大对照孔
4． 加入25微升上述配制的HEPENGBIO标准液（ReagentF）到相应标准样品孔里
5． 加入25微升样品（100微克蛋白总量）到待测样品孔里
6． 放进37℃培养箱里孵育30分钟
7． 分别加入25微升HEPENGBIO氧化工作液到标准样品孔和待测样品孔里
8． 加入25微升HEPENGBIO缓冲液（ReagentC）到最大对照孔
9． 轻轻摇动黑色96孔板，使其混匀
10． 放进37℃培养箱里孵育15分钟
11． 即刻放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪里测读：激发波长485nm±20，散发波长528nm±20，增益倍数25至100
12． 分析结果：
1） 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为荧光单位；横座标（X轴）为标准Trolox浓度（微摩尔/升）
2） 最大对照孔为最大荧光单位读数
3） 标准样品孔和待测样品孔为实际荧光单位读数
4） 根据标准曲线获得样品对应Trolox浓度（微摩尔/升）
5） 计算样品实际总抗氧化能力
【根据标准曲线获得样品对应Trolox浓度（微摩尔/升）X 0.2（体系容量；毫升）X样品稀释倍数】÷0.025（样品容量；毫升）＝（微摩尔/升TROLOX等值）
6） 根据下列公式计算测定体系中样品量的总抗氧化能力（实际抑制百分率）
【实际荧光单位读数÷最大对照孔荧光单位读数】X 100％
7） IC50：50％抑制率所需的样品单位：TROLOX等值（微摩尔/升）或样品蛋白量（毫克/毫升）或样品细胞量（106细胞）
X（所需样品单位）＝（已知样品单位÷实际抑制百分率）X 50％
注意事项
1． 本产品为50次操作，包括标准品
2． 本产品测试范围为100纳摩尔至1微摩尔Trolox等值
3． 操作时，须戴手套
4． 样品制备的所有操作均须在4℃状态下进行
5． 建议复孔操作
6． 标曲操作度要求较高：加样量、孵育时间等
7． 用户可以调整标准曲线区间，尤其出现标准5号管读数大于4号管读数时
8． 测试前，样品须新鲜收集
9． 样品须清澈
10． 样品读数越高，下降程度越小，抗氧化能力越高
11． 可以使用比色皿检测
12． 如果样品抗氧化剂浓度过高或过低，建议稀释或增加样品容量或浓度
13． 如果测试样品很多，建议使用排枪移液
14． 本公司提供系列抗氧化分析试剂产品
本产品仅供科研使用,请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
