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技术文章
HEPENGBIO细胞色素P450亚酶1A1活性荧光定量检测试剂盒产品说明书主要用途
点击次数：2668 发布时间：2024/7/18 10:50:41
HEPENGBIO细胞色素P450亚酶1A1活性荧光定量检测试剂盒产品说明书
主要用途
HEPENGBIO细胞色素P450亚酶1A1活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过乙氧基异吩噁唑脱乙基酶反应系统中乙氧基异吩噁唑转化为羟基异吩噁唑酮后荧光峰值的变化，即采用荧光法来测定样品中酶活性的技术方法。其适用于各种细胞或组织裂解萃取液样品（动物、人体）或纯化微粒体样品细胞色素P450亚酶1A1的总活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景
细胞色素P450亚酶1A1，简称为CYP1A1，又称芳香族碳氢化合物加羟基酶（aryl hydrocarbon hydrorylase；AHH）是肝细胞微粒体复合功能氧化酶系统的成员之一。CYP1A1由三个亚型：M1、M2、M3。其作用在于体内外源化合物（xenobiotics），包括药物、致癌剂、化学污染物的氧化代谢，即单加氧化作用（monooxygenation）和羟化作用（hydroxylation）。芳香族碳氢化合物诱导CYP1A1的表达。乙氧基异吩噁唑脱乙基酶（7-ethoxyresorufin O-deacylase；EROD）的活性是细胞色素P450亚酶1A1的诊断标记，其基于EROD选择性催化细胞色素P450亚酶1A1的活性。乙氧基异吩噁唑（7-ethoxyresorufin）在乙氧基异吩噁唑脱乙基酶的催化下，转化为羟基异吩噁唑酮（resorufin）后荧光峰值的变化（激发波长530nm，散发波长590nm），来定量测定细胞色素P450亚酶1A1的活性。乙氧基异吩噁唑脱乙基酶反应系统为：
EROD
7－ethoxyresorufin + NADPH → resorufin + NADP+
产品内容
HEPENGBIO缓冲液（Reagent A） 25毫升
HEPENGBIO反应液（Reagent B） 2.5毫升
HEPENGBIO底物液（Reagent C） 500微升
HEPENGBIO标准液（Reagent D） 50微升
产品说明书 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里，HEPENGBIO底物液（Reagent C）和HEPENGBIO标准液（Reagent D）避免光照，6月
用户自备
1.5毫升离心管：用于标准样品配制的容器
恒温水槽：用于孵育反应
比色皿或黑色96孔板：用于荧光分析的容器
荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光分析
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。
一、 测定准备
1． 准备好待测样品（例如细胞裂解萃取液或微粒体样品等），置于冰槽里
2． 设定好荧光分光光度仪（温度为37℃）：激发波长530nm，散发波长590nm，增益倍数100
3． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
4． 加入180微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent A）到1号管
5． 分别加入100微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent A）到2至5号管
6． 移取20微升HEPENGBIO标准液（Reagent D）到1号管，混匀
7． 小心移取100微升1号管稀释的HEPENGBIO标准液（Reagent D）到2号管，混匀
8． 小心移取100微升2号管稀释的HEPENGBIO标准液（Reagent D）到3号管，混匀
9． 小心移取100微升3号管稀释的HEPENGBIO标准液（Reagent D）到4号管，混匀
10． 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表
管号 | HEPENGBIO缓冲液（Reagent A） | HEPENGBIO标准液（Reagent D） | 标准羟基异吩噁唑酮浓度 |
1 | 180微升 | 20微升 | 200纳摩尔/升 |
2 | 100微升 | 100微升1号管 | 100纳摩尔/升 |
3 | 100微升 | 100微升2号管 | 50纳摩尔/升 |
4 | 100微升 | 100微升3号管 | 25纳摩尔/升 |
5 | 100微升 | 0 | 0 |
二、 标准曲线测定
1． 移取780微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2． 加入100微升HEPENGBIO反应液（Reagent B）
3． 加入20微升HEPENGBIO底物液（Reagent C）
4． 加入100微升上述配制的标准液
5． 上下倾倒数次，混匀
6． 在37℃温度下孵育10分钟
7． 即刻放进荧光分光光度仪检测：获得相对荧光单位（Relative Fluorescence Unit；RFU）
8． 重复实验步骤1至7四次
9． 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为相对荧光单位（RFU）；横座标（X轴）为标准羟基异吩噁唑酮浓度（纳摩尔/升）
三、 样品测定
1． 移取780微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2． 加入100微升HEPENGBIO反应液（Reagent B）
3． 加入20微升HEPENGBIO底物液（Reagent C）
4． 加入100微升待测样品（20微克微粒体蛋白或100微克细胞裂解萃取液蛋白）（注意：样品须清澈）
5． 上下倾倒数次，混匀
6． 在37℃温度下孵育10分钟
7． 即刻放进荧光分光光度仪检测：获得样品相对荧光单位（Relative Fluorescence Unit；RFU）
8． 根据标准曲线获得样品对应羟基异吩噁唑酮浓度（纳摩尔/升）
四、 计算样品实际活性
[根据标准曲线获得样品对应羟基异吩噁唑酮浓度（纳摩尔/升）X样品稀释倍数]÷ 10（分钟）＝皮摩尔/分钟/毫升
转换：皮摩尔/分钟/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝皮摩尔/分钟/毫克
五、 荧光酶标仪测定
1． 在黑色96孔板上做好相应标记：标准样品和待测样品
2． 分别移取195微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent A）到相应孔里
3． 分别加入25微升HEPENGBIO反应液（Reagent B）
4． 分别加入5微升HEPENGBIO底物液（Reagent C）
5． 分别加入25微升上述配制的标准液或待测样品（20微克微粒体蛋白或100微克细胞裂解萃取液蛋白）（注意：样品须清澈）
6． 轻轻摇动黑色96孔板
7． 在37℃温度下孵育10分钟
8． 即刻放进荧光酶标仪检测：获得相对荧光单位
9． 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为相对荧光单位；横座标（X轴）为标准羟基异吩噁唑酮浓度（纳摩尔）
10． 根据标准曲线获得样品对应羟基异吩噁唑酮浓度（纳摩尔/升）
11． 样品实际活性计算：
根据标准曲线获得样品对应羟基异吩噁唑酮浓度（纳摩尔/升）X样品稀释倍数]÷ 10（分钟）＝皮摩尔/分钟/毫升
转换：皮摩尔/分钟/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝皮摩尔/分钟/毫克
注意事项
1． 本产品为25次（比色皿）或85次（黑色96孔板）操作，包括标准液
2． 操作时，须戴手套
3． 系统操作过程中，标准液测定只需1次
4． 样品须澄清，至关重要（本公司提供HEPENGBIO细胞可溶性总蛋白质制备试剂盒）
5． 荧光检测易受到蛋白的干扰，例如牛血清白蛋白（bovine serum albumin；BSA）会与羟基异吩噁唑酮（resorufin）结合，导致荧光读数的降低
6． 如果样品读数低于背景读数明显，建议使用失活的样品和1号标准样品进行产物结合干扰测定
7． 孵育反应完成后即刻进行荧光测定
8． 如果酶活性过低，可以增加反应时间至30分钟
9． 荧光测定后，比色皿须清洗
10． 如果检测血液样品，建议使用HEPENGBIO体外非细胞系统细胞色素P450亚酶1A1活性荧光定量检测试剂盒
11． 建议待测样本为微粒体，其蛋白浓度为20微克/100微升；待测样本为细胞裂解悬液，其蛋白浓度为100至200微克/100微升（本公司提供HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒）
12． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
13． 用户可以使用CYP1A1选择性抑制剂α-萘黄酮（α-Naphthoflavone）作为阴性对照或抑制剂对照
14． 通常人体细胞微粒体细胞色素P450亚酶1A1活性浓度为：0.25±0.1皮摩尔/分钟/毫克蛋白
15． 细胞色素P450亚酶1A1单位活性定义为：在37℃，pH 7.5条件下，每分钟内能够转化1纳摩尔乙氧基异吩噁唑至羟基异吩噁唑酮所需的酶量作为一个活性单位
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
