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技术文章
还原糖含量试剂盒说明书 微量法 100 管/48 样
点击次数：2714 发布时间：2020/9/21 10:31:42
还原糖含量试剂盒说明书
微量法 100 管/48 样
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
还原糖广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。植物体内的还原糖主要包括葡萄糖、
果糖和麦芽糖等，是常见的单糖和双糖，其中葡萄糖和果糖不仅是呼吸作用的主要底物，
也是进一步合成蔗糖、淀粉和纤维素的底物。
测定原理：
加热促进碱性溶液中 3,5-二硝基水杨酸溶液与还原糖生成棕红色氨基化合物，在 540nm 有
特征吸收峰；在一定的浓度范围内，还原糖含量与 540nm 吸光度成线性关系，根据标准曲
线，即可求出样品中还原糖的量。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、蒸馏水。
试剂的组成和配制：
试剂一：100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：15mL×1 瓶 ，4℃保存；
样品中还原糖的提取：
1、细菌或细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量
（104个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 试
剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3S，间隔 10S，重复 30
次），转移到有盖离心管中（防止加热时水分散失），80℃水浴中 40min 并且振荡 8~10 次，
8000g，25℃离心 10min，取上清供测定用。
2、组织的处理：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g
组织，加入 1mL 试剂一），冰浴匀浆，转移到有盖离心管中（防止加热时水分散失），80℃
水浴中 40min 并且振荡 8~10 次，8000g，25℃离心 10min，取上清供测定用。
3、血清（浆）的处理：按照血清（浆）体积（mL）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建
议取 0.1mL 血清（浆）加入 1mL 试剂一），冰浴匀浆，转移到有盖离心管中（防止加热时水
分散失），80℃水浴中 40min 并且振荡 8~10 次，8000g，25℃离心 10min，取上清供测定用。
测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 540nm，蒸馏水调零。
2、 调节水浴锅至 95℃。
3、 在 EP 管中加入下列试剂：
试剂（μL） 对照管 测定管
样本 175 175
试剂二 125
蒸馏水 125
混匀匀，在 95℃水浴中加热 5min（盖紧，防止水分散失），取出后立即冷却至室温，混匀。
取 200μL 至微量石英比色皿或 96 孔板中，540nm 波长下读取对照管和测定管吸光值。计
算 ΔA=A 测定-A 对照。
注意：1、每个测定管需设一个对照管。
2、如果 ΔA 大于 2，需要将样本用试剂一稀释，计算公式中乘以相应稀释倍数。
还原糖含量计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、标准条件下测定回归方程为 y = 8.5067x-2.0807；x 为标准品浓度（mg/mL），y 为吸光值。
2、按样本鲜重计算：
还原糖(μg/g 鲜重)=[1000×(ΔA＋2.0807)÷8.5067×V1]÷(W×V1÷V2)=117.55×(ΔA＋2.0807)÷W
3、按样本蛋白浓度计算：
还原糖(μg/mg prot)=[1000×(ΔA＋2.0807) ÷8.5067×V1]÷(V1×Cpr)=117.55×(ΔA＋2.0807)÷Cpr
4、按细菌或细胞密度计算：
还原糖(μg /104
cell)=[1000×(ΔA＋2.0807) ÷8.5067×V1]÷（500×V1÷V2）=0.235×(ΔA＋2.0807)
5、按血清（浆）体积计算：
还原糖(μg/mL)=[1000×(ΔA＋2.0807) ÷8.5067×V1]÷（V3×V1÷V2）=1175.5×(ΔA＋2.0807)
1000：1mg/mL=1000µg/mL；V1：加入样本体积，0.175mL；V2：加入试剂一体积，1 mL；
V3：加入血清（浆体积），0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：
细菌或细胞总数，500 万。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
1、标准条件下测定回归方程为 y = 4.2534x -2.0807；x 为标准品浓度（mg/mL），y 为吸光值。
2、按样本鲜重计算：
还原糖（μg/g 鲜重）＝[1000×(ΔA＋2.0807)÷4.2534×V1]÷(W×V1÷V2)=235.1×(ΔA＋2.0807)÷W
3、按样本蛋白浓度计算：
还原糖（μg/mg prot）= [1000×(ΔA＋2.0807) ÷4.2534×V1]÷(V1×Cpr)=235.1×(ΔA＋2.0807)÷Cpr
4、按细菌或细胞密度计算：
还原糖（μg/104
cell）= [1000×(ΔA＋2.0807) ÷4.2534×V1]÷（500×V1÷V2）=0.47×(ΔA＋2.0807)
5、按血清（浆）体积计算：
还原糖（μg/mL）＝[1000×(ΔA＋2.0807) ÷4.2534×V1]÷（V3×V1÷V2）=2351×(ΔA＋2.0807)
1000：1mg/mL=1000µg/mL；V1：加入样本体积，0.175mL；V2：加入试剂一体积，1 mL；
V3：加入血清（浆体积），0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：
细菌或细胞总数，500 万。
注意：低检测限为 1mg/g 鲜重或 10μg/mg prot
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
