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技术文章
海藻糖酶（Trehalase，THL）试剂盒说明书 微量法 100 管/48 样
点击次数：2722 发布时间：2020/9/21 10:22:27
海藻糖酶（Trehalase，THL）试剂盒说明书
微量法 100 管/48 样
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
THL（EC 3.2.1.28）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。海藻糖酶主要功能在于
生物体分解海藻糖生成葡萄糖而直接用于能量供应。
测定原理：
采用 3,5－二硝基水杨酸法测定 THL 催化海藻糖产生的还原糖的含量。还原糖与 3,5－二硝
基水杨酸共热生成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正
比，由此判断 THL 活性的低。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸
馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 7mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1 支 ，4℃保存，用时加入 1mL 试剂一，充分溶解待用；用不完的试剂 4℃
保存；
试剂三：液体 10mL×1 瓶，4℃保存；
试剂四：液体 10mL×1 瓶，常温保存；
样品测定的准备：
1、细菌或细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量
（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提
取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3S，间隔 10S，重复 30
次）；8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织的处理：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g
组织，加入 1mL 提取液），冰浴中匀浆。8000g ，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）的处理：按照血清（浆）体积（mL）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建
议取 0.1mL 血清（浆）加入 1mL 提取液），冰浴中匀浆。8000g ，4℃离心 10min，取上清，
置冰上待测。
测定步骤
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 550nm，蒸馏水调零。
2、 调节水浴锅至 95 度。
3、加样表（在 EP 管中依次加入下列试剂）：
37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴，准确反应 10min
试剂三 95 95
试剂名称（μL） 对照管 测定管
样本 40 40
试剂一 70 50
试剂二 20
试剂四 95 95
混匀，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失），冷却后，取 200μL 至微量石英比色皿
或 96 孔板中分别测定 550nm 处测定管和对照管吸光值。计算 ΔA=A 测定管-A 对照管。
每个测定管需设一个对照管。
THL 活力计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、标准条件下测定回归方程为 y = 1.311x - 0.6264；x 为标准品浓度（mg/mL），y 为吸光值。
2、按照蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
THL 活力(μg/min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.6264) ÷1.311×V1]÷(V1×Cpr)÷T =76× (ΔA+0.6264)
÷Cpr。
3、按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
THL 活力(μg/min/g 鲜重)=[1000×(ΔA+0.6264) ÷1.311×V1]÷(W ×V1÷V2)
÷T=76×(ΔA+0.6264)÷W。
4、按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
THL 活力(μg/min/104
cell) =[1000×(ΔA+0.6264) ÷1.311×V1]÷(500×V1÷V2)
÷T=0.152×(ΔA+0.6264)
5、按血清（浆）体积计算
单位的定义：每 mL 血清（浆）每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
THL 活力(μg/min/mL)= [1000×(ΔA+0.6264) ÷1.311×V1]÷(V3×V1÷V2) ÷T=760×(ΔA+0.6264)。
1000：1mg/mL=1000µg/mL； V1：加入样本体积：0.04mL；V2：加入提取液体积，1 mL；
V3：加入血清（浆）体积，0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：
细菌或细胞总数，500 万；T：反应时间，10min；
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
1、标准条件下测定回归方程为 y = 0.6555x-0.6264；x 为标准品浓度（mg/mL），y 为吸光值。
2、按照蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白在每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
THL 活力(μg/min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.6264)÷0.6555×V1]÷(V1×Cpr)÷T=152×(ΔA+0.6264)
÷Cpr。
3、按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
THL 活力(μg/min/g 鲜重)= [1000×(ΔA+0.6264) ÷0.6555×V1]÷(W ×V1÷V2) ÷T
=152×(ΔA+0.6264)÷W。
4、按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
THL 活力(μg/min/104
cell)=[1000×(ΔA+0.6264) ÷0.6555×V1]÷(500×V1÷V2) ÷T
=0.304×(ΔA+0.6264)
5、按血清（浆）体积计算
单位的定义：每 mL 血清（浆）每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
THL 活力(μg/min /mL)=[1000×(ΔA+0.6264) ÷0.6555×V1]÷(V3×V1÷V2)÷T
=1520×(ΔA+0.6264)。
1000：1mg/mL=1000µg/mL； V1：加入样本体积：0.04mL；V2：加入提取液体积，1 mL；
V3：加入血清（浆）体积，0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：
细菌或细胞总数，500 万；T：反应时间，10min；
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
