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技术文章
丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK）试剂盒说明书 微量法 100 管/96 样
点击次数：2907 发布时间：2020/9/17 10:37:45
丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK）试剂盒说明书
微量法 100 管/96 样
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
PK（EC 2.7.1.40）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化糖酵解过程中的
后一步反应，是糖酵解过程中的主要限速酶之一，也是产生 ATP 的关键酶之一，因此测定
PK 活性具有重要意义。
测定原理
PK 催化磷酸烯醇式丙酮酸和 ADP 生成 ATP 和丙酮酸，乳酸脱氢酶进一步催化 NADH 和丙
酮酸生成乳酸和 NAD+，在 340nm 下测定 NADH 下降速率，即可反映 PK 活性。
需自备的仪器和用品
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、
研钵、冰和蒸馏水
试剂的组成和配制
提取液：100mL×1 瓶，4℃保存;
试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；；
试剂二：粉剂×1 支，-20℃保存；
试剂三：液体×1 支，4℃保存；
样本的前处理
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量
（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提
取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；
8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，
加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定
（1）在试剂二瓶中加入 17mL 试剂一和 1mL 蒸馏水充分溶解，置于 37℃（哺乳动物）或
25℃（其它物种）水浴 5min；现配现用；
（2）在试剂三中加入 1mL 蒸馏水充分溶解，冰上放置备用；现配现用；
（3）在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、10μL 试剂三和 180μL 试剂二，混
匀，立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 2min20s 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。
PK 活性计算
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清（浆）中 PK 活力的计算:
单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷V 样÷T=1608×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 PK 活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(V 样×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PK（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=1608×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PK（nmol/min /104
cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=3.216×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10-4
L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103
L / mol /cm；d：
比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：
反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总
数，500 万。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
1、血清（浆）中 PK 活力的计算:
单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PK（nmol/min /mL）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷V 样÷T=3216×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 PK 活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(V 样×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PK（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=3216×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PK（nmol/min /104
cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=6.432×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10-4
L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103
L / mol /cm；d：
96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：
反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总
数，500 万。
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
