企业档案
会员类型：标准版
已获得阿仪网信誉 等级评定
(0 -40)基础信誉积累，可浏览访问
(41-90)良好信誉积累，可接洽商谈
(91+ )优质信誉积累，可持续信赖
阿仪网标准版会员：11年
工商认证 【已认证】
最后认证时间：
注册号： 【已认证】
法人代表： 【已认证】
参观次数：4594575
技术文章
丙酮酸脱氢酶（Pyruvate dehydrogenase，PDH）试剂盒说明书 微量法 100 管/96 样
点击次数：2739 发布时间：2020/9/17 8:40:07
丙酮酸脱氢酶（Pyruvate dehydrogenase，PDH）试剂盒说明书
微量法 100 管/96 样
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
PDH（EC 4.1.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是丙酮酸脱氢酶复合体
(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶，催化丙酮酸脱梭生成羟乙基-TPP，把糖酵解和三羧
酸循环连接起来。
测定原理
PDH 催化丙酮酸脱氢，同时还原 2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），从而导致 600nm 光吸收的
减少。
需自备的仪器和用品
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、
研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
试剂一：100mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：20mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：1.5mL×1 支，-20℃保存；
试剂四：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；
试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存；
样本的前处理
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器
或研钵匀浆。
2、 将匀浆 600g，4℃离心 5min。
3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
4、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 PDH（此步可选做）。
5、 在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或
200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 PDH 活性测定。
测定步骤
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 605nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定
（1）在试剂五中加入 19mL 试剂四充分溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）
水浴 10min；用不完的试剂 4℃保存一周；
（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本和190μL试剂五，混匀，立即记录605nm
处初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。
PDH 活性计算
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH 活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(V 样×Cpr) ÷T=952×ΔA÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH活性（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109
]÷(W× V样÷V样总) ÷T=192×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH 活性（nmol/min /104
cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.385×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10-4
L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104
L / mol /cm；
d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；
T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细
胞总数，500 万。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH 活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(V 样×Cpr) ÷T=1904×ΔA÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH 活性（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=384×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH 活性（nmol/min /104
cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.77×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10-4
L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104
L / mol /cm；
d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202
mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌
或细胞总数，500 万
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
