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技术文章
羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）试剂盒说明书 微量法 100T/96S
点击次数：2681 发布时间：2020/9/17 8:32:09
羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）试剂盒说明书
微量法 100T/96S
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
HYP 是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此
HYP 含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。
测定原理：
样品经水解产生游离的 HYP，进一步被氯胺 T 氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，
产生红色化合物，在 560nm 处有特征吸收峰。通过测定样品水解液 560nm 吸光值，可计算
HYP 含量。
自备实验用品及仪器：
天平、烘箱、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、
6mol/L 盐酸和蒸馏水。
试剂组成和配制：
组织提取液：6mol/L 盐酸，自备。浓盐酸：H2O（V/V）= 1:1，室温保存。
细胞提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 6mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂二：液体 6mL×1 瓶，4℃避光保存。
羟脯氨酸提取：
1. 组织：称取约 0.2g 样品于玻璃管，加入 2mL 的组织提取液，置于 110℃烘箱，水解 6
至 12 小时，12000g，25℃，离心 20min，用提取液定容至 2mL，取上清待测。
2. 细胞：取约 500 万个细胞，加入 1mL 的细胞提取液，于压消毒器中 15 磅保持 30min，
自然降压后待测。
3. 血清等液体：直接测定。
测定操作表：
1、 分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长至 560nm，蒸馏水调零。
2、 操作表
对照管 测定管
样本（µL） 60
试剂一（µL） 60 60
混匀，室温静置 20min
试剂二（µL） 60 60
H2O（µL） 180 120
混匀，60℃，20min，取出后 25℃静置 15 min，取 200µL 于微量石英比色皿/96 孔板中检测
560nm 处吸光值。ΔA=A 测定-A 对照
羟脯氨酸含量计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y=64.875x+ 0.0251，R
2
=0.9991
（1）按样品重量计算
组织羟脯氨酸含量（mg/g）=（ΔA-0.0251）÷64.875×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)
= 0.154×（A560-0.0251）÷W
（2）按细菌或细胞密度计算
细胞羟脯氨酸含量（mg/104
cell）=（ΔA-0.0251）÷64.875×V 反总÷V 样×V 样总÷细胞数量（万
个）= 0.077×（A560-0.0251）÷ 细胞数量（万个）
（3）按液体体积计算
HYP 含量（mg/mL）=（A560-0.0251）÷ 64.875×V 反总÷V 样
= 0.077×（A560-0.0251）
V 反总：反应总体积，0.3 mL；V 样：反应中样品体积，0.06mL；V 样总：加入提取液体积，
mL；W：样本重量，g
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y=32.4375x+ 0.0251，R
2
=0.9991
（1）按样品重量计算
HYP 含量（mg/g）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)
= 0.308×（A560-0.0251）÷W
（2）按细菌或细胞密度计算
HYP 含量（mg/104
cell）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V 反总÷V 样×V 样总÷细胞数量（万个）
= 0.154×（A560-0.0251）÷细胞数量（万个）
（3）按液体体积计算
HYP 含量（mg/mL）=（A560-0.0251）÷32.4375×V 反总÷V 样
= 0.154×（A560-0.0251）
V 反总：反应总体积，0.3 mL；V 样：反应中样品体积，0.06mL；V 样总：加入提取液体积，
mL；W：样本重量，g
注意事项：
1、 吸光值大于 0.8，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数。
2、 试剂有一定的毒性，请操作时做好防护措施，防止吸入或与皮肤接触。
3、 低检出限为 3.8mg/L。
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
