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技术文章
半胱氨酸（cysteine, Cys）含量测定试剂盒说明书 微量法 100T/96S
点击次数：2758 发布时间：2020/9/17 8:30:15
半胱氨酸（cysteine, Cys）含量测定试剂盒说明书
微量法 100T/96S
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
蛋白质含有三种含硫氨基酸：甲硫氨酸、胱氨酸和 Cys。其中，Cys 是唯一一种含有巯基的
含硫氨基酸，从甲硫氨酸转化而来，并且可与胱氨酸互相转化。Cys 参与蛋白质二硫键的形
成，经常是蛋白质活性中心的组成部分，还可以为其它生理生化反应提供巯基。此外，Cys
大量积聚在皮肤和粘膜表面，在角蛋白生成中维持重要的巯基酶的活性，并且补充巯基，以
维持皮肤的正常代谢，调节表皮下层的色素细胞生成的底层黑色素。具有美白、解毒、改
善炎症和过敏性皮肤等作用。
测定原理：
Cys 还原磷钨酸生成钨蓝，在 600nm 处有吸收峰；通过 600nm 吸光度，计算 Cys 含量。
自备仪器和用品：
低温离心机、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、磷酸和蒸
馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。用前 1 天，向试剂三中加 2.5mL 蒸馏水充分溶解，再加磷酸
0.625mL，混匀后盖紧（防止水分散失）沸水浴 2h；冷却后加 10mL 蒸馏水，4℃可保存 2
周。
标准品：液体×1 瓶，1μmol/mL 标准液，4℃保存。
半胱氨酸提取：
1、 液体样品中半胱氨酸提取：取 0.1mL 液体样品，加试剂一 0.9mL，充分混匀，8000g
4℃离心 10min，取上清液，待测。
2、 组织中半胱氨酸提取：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称
取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心 10 min，取上清液待
测。
3、 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量
（104个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL
试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复
30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 600 nm，蒸馏水调零。
2. 空白管：取微量石英比色皿/96 孔板，加入 20μL 蒸馏水，100μL 试剂二，100μL 试剂三，
混匀后室温静置 15 min，于 600nm 处测定吸光值，记为 A 空白管。
3. 标准管：取微量石英比色皿/96 孔板，加入 20μL 标准液，100μL 试剂二，100μL 试剂三，
混匀后室温静置 15 min，于 600nm 处测定吸光值，记为 A 标准管。
4. 测定管：取微量石英比色皿/96 孔板，加入 20μL 上清液，100μL 试剂二，100μL 试剂三，
混匀后室温静置 15 min，于 600nm 处测定吸光值，记为 A 测定管。
注意：空白管和标准管只需要做一次。
计算公式：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1. 按液体样品的体积计算：
半胱氨酸含量（μmol/mL）=[C 标准品×V 标准品×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空
白管)]×（V 样总÷V 样）=1×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)
2. 按样本质量计算：
半胱氨酸含量（μmol/g）=[C 标准品×V 标准品×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白
管)]×（V 样总÷V 样）÷W=1×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管) ÷W
3. 按照蛋白浓度计算：
半胱氨酸含量（μmol /mg prot）= [C 标准品×V 标准品×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－
A 空白管)]÷（V 样×Cpr）=1×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管) ÷Cpr
4. 按细胞数量计算：
氨基酸含量（μmol /104 cell）=[C 标准品×V 标准品×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A
空白管)] ×（V 样总÷V 样×细胞数量）=1×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管) ÷细
胞数量
C 标准品：标准品浓度，1 μmol/mL；V 标准品：反应体系中加入标准品体积，0.02mL；V
样：反应体系中加入样品提取液体积，0.02 mL；V 样总：样品提取液，1mL；W：样品质
量，g。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下
1. 按液体样品的体积计算：
半胱氨酸含量（μmol/mL）=[C 标准品×V 标准品×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空
白管)]×（V 样总÷V 样）=1×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)
2. 按质量计算：
半胱氨酸含量（μmol/g）=[C 标准品×V 标准品×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白
管)]×（V 样总÷V 样）÷W=1×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管) ÷W
3. 按照蛋白浓度计算：
半胱氨酸含量（μmol /mg prot）= [C 标准品×V 标准品×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－
A 空白管)]÷（V 样×Cpr）=1×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管) ÷Cpr
4. 按细胞数量计算：
氨基酸含量（μmol /104 cell）=[C 标准品×V 标准品×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A
空白管)] ×（V 样总÷V 样×细胞数量）=1×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管) ÷细
胞数量
C 标准品：标准品浓度，1 μmol/mL；V 标准品：反应体系中加入标准品体积，0.02mL；V
样：反应体系中加入样品提取液体积，0.02 mL；V 样总：样品提取液，1mL；W：样品质
量，g。
注意事项：
低检出限为 100μ mol/L。
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
