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技术文章
氨基酸(amino acid, AA)含量测定试剂盒说明书 微量法 100T/96S
点击次数：2727 发布时间：2020/9/17 8:29:07
氨基酸(amino acid, AA)含量测定试剂盒说明书
微量法 100T/96S
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
动物肝脏、肾脏是氨基酸代谢的主要器官，故尿中氨基酸的变化能反应肝、肾的生理状态。
另外，氨基酸还能反应灼伤、伤寒等方面情况。植物体内氨基酸含量对研究植物在不同条件
下及不同生长发育时期氮代谢变化、植物对氮素的吸收、运输、同化及营养状况等有重要意
义。
测定原理：
氨基酸的 α -氨基可与水合茚三酮反应，产生蓝紫色化合物，在 570 nm 有特征吸收峰；通过
测定 570 nm 吸光度，来计算氨基酸含量。
自备仪器及用品：
台式离心机、水浴锅、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、可调式移液枪、
研钵、无水乙醇、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1 瓶（棕色），4℃避光保存。临用前加入 667μL 无水乙醇，盖紧后充分混匀，
再加入 9.333 mL 蒸馏水混匀，避光保存。
试剂四：粉剂×1 管，4℃避光保存。临用前加 1 mL 蒸馏水，充分溶解。
标准品：液体×1 支，1μmol/mL 标准液，4℃避光保存。
样品中 AA 提取：
1. 按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入
1mL 试剂一）进行室温匀浆，然后转移到 1.5 mL EP 管中，盖紧后（防止水分散失）置
于沸水浴提取 15 min；自来水冷却后，8000g，，4℃离心 10min，上清液置冰上待测。
2. 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量
（104个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL
试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复
30 次）；8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3. 血清等液体：直接检测。
测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 570 nm，蒸馏水调零。
2. 空白管：取 EP 管，加入 10μL 蒸馏水，100μL 试剂二，100μL 试剂三和 10μL 试剂四，混
匀后盖紧瓶盖（防止水分散失），置于沸水浴中保温 15 min，冷却后反复颠倒 EP 管数次，
于 570nm 测定吸光值，记为 A 空白管。显色后务必在 30min 内测完。
3. 标准管：取 EP 管，加入 10μL 标准品，100μL 试剂二，100μL 试剂三和 10μL 试剂四，混
匀后盖紧瓶盖（防止水分散失），置于沸水浴中保温 15 min，冷却后反复颠倒 EP 管数次，
于 570nm 测定吸光值，记为 A 标准管。显色后务必在 30min 内测完。
4. 测定管：取 EP 管，加入 10μL 上清液，100μL 试剂二，100μL 试剂三和 10μL 试剂四，混
匀后盖紧瓶盖（防止水分散失），置于沸水浴中保温 15 min，冷却后反复颠倒 EP 管数次，
于 570nm 测定吸光值，记为 A 测定管。显色后务必在 30min 内测完。
注意：空白管和标准管只需要测定一次。
氨基酸含量计算公式：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
氨基酸含量（μmol /mg prot）= [C 标准品×V 标准品×(A 测定－A 空白)÷(A 标准－A 空白)]÷
（V 样×Cpr）
=1×(A 测定－A 空白)÷(A 标准－A 空白) ÷Cpr
（2）按样本质量计算
氨基酸含量（μmol /g）=[C 标准品×V 标准品×(A 测定－A 空白)÷(A 标准－A 空白)] ÷（V 样
总÷V 样）÷W
=1×(A 测定－A 空白)÷(A 标准－A 空白) ÷W
（3）按细胞数量计算
氨基酸含量（μmol /104 cell）=[C 标准品×V 标准品×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A
空白管)] ×（V 样总÷V 样×细胞数量）
=1×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管) ÷细胞数量
（4）按照液体体积计算
氨基酸含量（μmol /mL）=[C 标准品×V 标准品×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白
管)]÷V 样
=1×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)
C 标准品：标准品浓度，1 μmol/mL；V 标准品：反应体系中加入标准品体积，0.05 mL；W：
样品质量，g；V 样：反应体系中加入样品提取液体积，0.05 mL；V 样总：样品提取液总体
积，1mL；；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
氨基酸含量（μmol /mg prot）=[C 标准品×V 标准品×(A 测定－A 空白)÷(A 标准－A 空白)] ÷
（V 样×Cpr）
=1×(A 测定－A 空白)÷(A 标准－A 空白) ÷Cpr
（2）按样本质量计算
氨基酸含量（μmol /g）=[C 标准品×V 标准品×(A 测定－A 空白)÷(A 标准－A 空白)]×（V 样
总÷V 样）÷W
=1×(A 测定－A 空白)÷(A 标准－A 空白) ÷W
（3）按细胞数量计算
氨基酸含量（μmol /104 cell）= [C 标准品×V 标准品×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A
空白管)] ×（V 样总÷V 样×细胞数量）
=1×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管) ÷细胞数量
（4）按照液体体积计算
氨基酸含量（μmol /mL）=[C 标准品×V 标准品×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白
管)]÷V 样
=1×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)
C 标准品：标准品浓度，1 μmol/mL；V 标准品：反应体系中加入标准品体积，0.05 mL；W：
样品质量，g；V 样：反应体系中加入样品提取液体积，0.05 mL；V 样总：样品提取液总体
积，1mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL。
注意事项：
1. 试剂盒中试剂三和试剂四均需临用前配制，且避光保存，配制好未使用完的 4℃保存且 3
天内使用完毕。
2. 为保证实验结果的准确性，需先取 1-2 个样做预实验，如果测定的吸光值过（于 2.5），
用蒸馏水稀释后再测定。
3. 脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应在 570nm 处无吸收峰，因此，570nm 处测定结果不含这
两种氨基酸的量。
4．低检出限为 100μ mol/L
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
