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技术文章
硫氧还蛋白过氧化物酶（TPX）活性测定试剂盒说明书 微量法 100T/96S
点击次数：2749 发布时间：2020/9/15 9:48:29
硫氧还蛋白过氧化物酶（TPX）活性测定试剂盒说明书
微量法 100T/96S
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
TPX 属于过氧化物酶家族，在体内主要通过还原过氧化氢和一些氢过氧化物来实现抗氧化
作用，功能与 GPX 类似，也是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。TPX 普遍存在于各种生
物体内，如酵母、植物、动物、原生动物、寄生虫、细菌和古细菌，在进化上度保守。
TPX 与细胞增殖、分化、细胞凋亡及肿瘤发生调控密切相关。TPX 的主要功能包括细胞脱
毒、抗氧化和调节由过氧化氢介导的信号转导和免疫反应。
测定原理：
TPX 催化 H2O2 氧化二硫苏糖醇（DTT），H2O2的吸收波长为 240nm，通过测定 240nm 吸光
度的下降速率，通过对照减去过氧化氢酶（CAT）催化分解的 H2O2，即可计算出 TPX 活性。
因此，本试剂盒可以同时测定样品 TPX 和 CAT 活性。
自备仪器和用品:
低温离心机、水浴锅、可调节移液器、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板（UV
板）、和蒸馏水
试剂组成和配制:
试剂一：液体×1 瓶，室温保存。
试剂二：液体×1 瓶，- 20℃保存。
试剂三：液体×1 支，4℃。
粗酶液提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，
加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建
议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7
秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
3. 血清等液体：直接测定。
TPX 测定操作：
1. 分光光度/酶标仪计预热 30min，调节波长到 240 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂一和试剂二置于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）水浴预热 30 min。
3. CAT 活性测定管：取微量石英比色皿或 96 孔板，加入 4 μL 上清液，180 μL 试剂一，16 μL
试剂三，迅速混匀后于 240 nm 测定 10s 和 130s 吸光度，记为 A1 和 A2。
4.总活性测定管：取取微量石英比色皿或 96 孔板，加入 4 μL 上清液，180 μL 试剂二，16 μL
试剂三，迅速混匀后于 240 nm 测定 10s 和 130s 吸光度，记为 A3 和 A4。
注意：每个样品都需要做对照管，以减去过氧化氢酶（CAT）催化降解的 H2O2。
TPX 活性计算公式：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1). 按蛋白浓度计算
活性单位定义：25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分钟催化 1nmol H2O2降解为 1 个酶活单位。
CAT 活性（nmol/min /mg prot）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反总÷（Cpr×V 样）÷T
=573×(A1－A2)÷Cpr
总活性（nmol/min /mg prot）=（A3－A4）÷ε÷d×V 反总÷（Cpr×V 样）÷T=573×(A3－A4)÷Cpr
TPX 活性（nmol/min /mg prot）=总活性－CAT 活性
(2). 按样本质量计算
活性单位定义：25℃或者 37℃中，每克样本每分钟催化 1nmol H2O2降解为 1 个酶活单位。
CAT 活性（nmol/min/g）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T
=573×(A1－A2)÷W
总活性（nmol/min/g）=（A3－A4）÷ε÷d×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T
=573×(A3－A4)÷W
TPX 活性（nmol/min /g）=总活性－CAT 活性
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：25℃或者 37℃中，每 104个细胞每分钟催化 1nmol H2O2降解为 1 个酶活单
位。
CAT 活性（nmol/min/104 cell）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T
=573×(A1－A2)÷细胞数量
总活性（nmol/min/104 cell）=（A3－A4）÷ε÷d×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T
=573×(A3－A4)÷细胞数量
TPX 活性（nmol/min/104 cell）=总活性－CAT 活性
（4）按液体体积计算
活性单位定义：25℃或者 37℃中，每毫升液体每分钟催化 1nmol H2O2降解为 1 个酶活单位。
CAT 活性（nmol/min /mL）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反总÷V 样÷T
=573×(A1－A2)
总活性（nmol/min /mL）=（A3－A4）÷ε÷d×V 反总÷V 样÷T
=573×(A3－A4)
TPX 活性（nmol/min /mL）= 总活性－CAT 活性
ε：H2O2 的摩尔消光系数，43600 L/mol/cm=0.0436 L/μmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反
总：反应体系总体积（L），200 μ L=2×10-4
L；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL）；W ：样
品质量；V 样：加入反应体系中上清液体积（mL），4 μL=4×10-3 mL；V 样总：提取液体积，
1 mL；T：反应时间（min），2min。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下
(1). 按蛋白浓度计算
活性单位定义：25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分钟催化 1nmol H2O2降解为 1 个酶活单位。
CAT 活性（nmol/min /mg prot）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反总÷（Cpr×V 样）÷T
=1146×(A1－A2)÷Cpr
总活性（nmol/min /mg prot）=（A3－A4）÷ε÷d×V 反总÷（Cpr×V 样）÷T
=1146×(A3－A4)÷Cpr
TPX 活性（nmol/min /mg prot）=总活性－CAT 活性
(2). 按样本质量计算
活性单位定义：25℃或者 37℃中，每克样本每分钟催化 1nmol H2O2降解为 1 个酶活单位。
CAT 活性（nmol/min/g）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T
=1146×(A1－A2)÷W
总活性（nmol/min/g）=（A3－A4）÷ε÷d×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T
=1146×(A3－A4)÷W
TPX 活性（nmol/min /g）=总活性－CAT 活性
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：25℃或者 37℃中，每 104个细胞每分钟催化 1nmol H2O2降解为 1 个酶活单
位。
CAT 活性（nmol/min/104 cell）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T
=1146×(A1－A2)÷细胞数量
总活性（nmol/min/104 cell）=（A3－A4）÷ε÷d×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T
=1146×(A3－A4)÷细胞数量
TPX 活性（nmol/min/104 cell）=总活性－CAT 活性
（4）按液体体积计算
活性单位定义：25℃或者 37℃中，每毫升液体每分钟催化 1nmol H2O2降解为 1 个酶活单位。
CAT 活性（nmol/min /mL）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反总÷V 样÷T
=1146×(A1－A2)
总活性（nmol/min /mL）=（A3－A4）÷ε÷d×V 反总÷V 样÷T
=1146×(A3－A4)
TPX 活性（nmol/min /mL）= 总活性－CAT 活性
ε：H2O2的摩尔消光系数，43600 L/mol/cm=0.0436 L/μmol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V
反总：反应体系总体积（L），200 μL=2×10-4
L；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL）；W ：
样品质量；V 样：加入反应体系中上清液体积（mL），4 μ L=4×10-3 mL；V 样总：提取液体
积，1 mL；T：反应时间（min），2min
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
