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技术文章
乙醇脱氢酶（ADH）活性测定试剂盒说明书 微量法 100T/96S
点击次数：2872 发布时间：2020/9/15 8:57:03
乙醇脱氢酶（ADH）活性测定试剂盒说明书
微量法 100T/96S
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
ADH 是生物体内短链醇代谢的关键酶，催化乙醇与乙醛可逆转换，在很多生理过程中起着
重要作用。哺乳动物 ADH 主要在肝脏生成，肝脏损伤导致 ADH 释放到血清中。血清 ADH
活性低反映了肝功能是否异常。
测定原理：
ADH 催化 NADH 还原乙醛生成乙醇和 NAD+，NADH 在 340nm 处有吸收峰，而 NAD+没有；
测定 340nm 吸光度下降速率，来计算 ADH 活性。
自备仪器和用品：
研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、可调式移液器
和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体×1 瓶，室温保存。
试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。临用前把试剂三转移到试剂二中，4℃保存。
试剂三：粉剂×1 瓶，－20℃保存。
试剂四：液体×1 支，4℃保存。
粗酶液提取：
1、 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，
加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。16000g，4℃离心 20min，取上清置冰上待测。
2、 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建
议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7
秒，总时间 3min）；16000g， 4℃离心 20min，取上清液置冰上待测。
3、血清等液体：直接测定。
ADH 测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 340 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂二在 25℃水浴中保温 30 min。
3. 空白管：在微量石英比色皿/96 孔板中依次加入 20μL 蒸馏水、160μL 试剂二和 20μL 试剂
四，迅速混匀后于 340nm 测定吸光值变化，分别记录 15s 和 75s 时吸光值，分别记为 A1
和 A2。△ A 空白管=A1-A2。
4. 测定管：在微量石英比色皿/96 孔板中依次加入 20μL 上清液、160μL 试剂二和 20μL 试剂
四，迅速混匀后于 340nm 测定吸光值变化，分别记录 15s 和 75s 时吸光值，分别记为 A3
和 A4。△ A 测定管=A3-A4。
注意：空白管只需测定一次。
计算公式：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按照蛋白浓度计算
活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1μmol NADH 为 1 个酶活单位。
ADH (μmol/min/mg prot) =[(△A 测定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×106
] ÷(Cpr×V 样)÷T
=1.61×(△A 测定管–△A 空白管) ÷Cpr
（2）按照样本质量计算
活性单位定义：25℃中每克组织每分钟氧化 1μmol NADH 为 1 个酶活单位。
ADH (μmol/min/g) =[(△A 测定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×106
] ÷(W×V 样÷V 样总)÷T
=1.61×(△A 测定管–△A 空白管) ÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：25℃中每 104 个细胞每分钟氧化 1μmol NADH 为 1 个酶活单位。
ADH (μmol/min/104
cell) = [(△A 测定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×106
] ÷(细胞数量×V 样÷V
样总)÷T
=1.61×(△A 测定管–△A 空白管) ÷细胞数量
（4）按液体体积计算
活性单位定义：25℃中每毫升血清每分钟氧化 1μmol NADH 为 1 个酶活单位。
ADH (μmol/min/mL) = [(△A 测定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×106
] ÷V 样÷T
=1.61×(△A 测定管–△A 空白管)
ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103
L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V 反总：反应体系总
体积，200μL=2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W ：样品质量；V 样：加入反
应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；V 样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，1min。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下
（1）按照蛋白浓度计算
活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1μmol NADH 为 1 个酶活单位。
ADH (μmol/min/mg prot) =[(△A 测定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×106
] ÷(Cpr×V 样)÷T
=1.61×(△A 测定管–△A 空白管) ÷Cpr
（2）按照样本质量计算
活性单位定义：25℃中每克组织每分钟氧化 1μmol NADH 为 1 个酶活单位。
ADH (μmol/min/g) =[(△A 测定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×106
] ÷(W×V 样÷V 样总)÷T
=1.61×(△A 测定管–△A 空白管) ÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：25℃中每 104 个细胞每分钟氧化 1μmol NADH 为 1 个酶活单位。
ADH (μmol/min/104
cell) = [(△A 测定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×106
] ÷(细胞数量×V 样÷V
样总)÷T
=1.61×(△A 测定管–△A 空白管) ÷细胞数量
（4）按液体体积计算
活性单位定义：25℃中每毫升血清每分钟氧化 1μmol NADH 为 1 个酶活单位。
ADH (μmol/min/mL) = [(△A 测定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×106
] ÷V 样÷T
=1.61×(△A 测定管–△A 空白管)
ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103
L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5 cm；V 反总：反应体系
总体积，200μL=2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W ：样品质量；V 样：加入
反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；V 样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，1min。
注意事项：
1. 上清液蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。
2. 配制好的试剂二 3 天使用完。
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
