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技术文章
丙酮酸脱羧酶（PDC）活性测定试剂盒微量法说明书-赫澎生物
点击次数：2710 发布时间：2020/9/15 8:47:11
规格：100 管/96 样
丙酮酸脱羧酶（PDC）活性测定试剂盒说明书
微量法
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
PDC主要存在于酵母中，是乙醇发酵的关键酶之一，催化丙酮酸脱羧生成乙醛。
测定原理：
PDC催化丙酮酸脱羧生成乙醛，添加乙醇脱氢酶（ADH）来进一步催化NADH还原乙醛生成乙
醇和NAD
+；NADH在340nm有吸收峰，而NAD
+没有；通过测定340nm光吸收下降速率，来计算PDC
活性。
自备仪器和用品：
研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液
枪和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂三：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂四：液体×1 瓶，﹣20℃保存。
混合试剂：临用前配制，小心把试剂四转移到试剂三中，充分溶解。
试剂六：液体×1 管，4℃保存。
粗酶液提取：
1、细菌或细胞处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每200万细菌或细胞加
入400μL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，工作3s，间歇10s，工作35次），16000g
4℃离心20min，取上清，置冰上待测。
2、组织处理：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，
加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，16000g 4℃离心20min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样品：直接检测。
PDC 测定操作：
1.分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到340nm，蒸馏水调零。
2.试剂二置于25℃水浴中预热30min。
3.空白管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL蒸馏水、20μL混合试剂、140μL试剂二
和20μL试剂六，迅速混匀后于340nm比色，记录15s和75s的吸光值，分别记为A1和A2。
4.测定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、20μL混合试剂、140μL试剂二
和20μL试剂六，迅速混匀后于340nm比色，记录15s和75s的吸光值，分别记为A3和A4。
注意：空白管只需测定一次。
PDC 活性计算：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按照蛋白浓度计算
活性单位定义：25℃中，每毫克蛋白每分钟催化1μmolNADH 氧化为1个酶活单位。
PDC (μmol/min/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 总×10
6}÷(Cpr×V样)÷T
=1.61×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr
（2）按照样本质量计算
活性单位定义：25℃中，每克组织每分钟催化 1μmol NADH 氧化为 1 个酶活单位。
PDC(μmol/min/g) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 总×10
6}÷(W×V样÷V样总) ÷T
=1.61×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：25℃中，每10
4个细胞每分钟催化1μmol NADH 氧化为1个酶活单位。
PDC (μmol/min/10
4cell) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 总×10
6}÷(细胞数量×V 样÷V 样总)
÷T=1.61×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷细胞数量
（4）按血清（浆）体积计算
活性单位定义：25℃中，每毫升血清（浆）每分钟催化1μmol NADH氧化为1个酶活单位。
PDC (μmol/min/mL) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 总×10
6}÷V 样÷÷T
=1.61×[(A3－A4)－(A1-A2)]
ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10
3 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 总：反应体系总体积，
0.2mL=2×10
-4 L，V 样：加入反应体系中上清液体积，0.02mL；V 样总：提取液体积，1 mL；
Cpr：蛋白浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量试剂盒；W ：样
品质量； T：反应时间，1 min。
b.使用96孔板测定的计算公式如下
（1）按照蛋白浓度计算
活性单位定义：25℃中，每毫克蛋白每分钟催化1μmol NADH氧化为1个酶活单位。
PDC (μmol/min/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 总×10
6}÷(Cpr×V 样) ÷T=3.22×
[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr
（2）按照样本质量计算
活性单位定义：25℃中，每克组织每分钟催化 1μmol NADH 氧化为1个酶活单位。
PDC (μmol/min/g) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 总×10
6}÷(W×V 样÷V 样总) ÷T=3.22×
[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：25℃中，每10
4个细胞每分钟催化1μmol NADH氧化为1个酶活单位。
PDC (μmol/min/10
4cell) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 总×10
6}÷(细胞数量×V 样÷V 样总)
÷T=3.22×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷细胞数量
（4）按血清（浆）体积计算
活性单位定义：25℃中，每毫升血清（浆）每分钟催化1μmol NADH 氧化为1个酶活单位。
PDC (μmol/min/mL) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 总×10
6}÷V 样÷÷T
=3.22×[(A3－A4)－(A1-A2)]
ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10
3L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；V 总：反应体系总体
积，0.2mL=2×10
-4 L，V 样：加入反应体系中上清液体积，0.02mL；V 样总：提取液体积，1 mL；
Cpr：蛋白浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量试剂盒；W ：样品
质量； T：反应时间，1min。
注意事项：配制好的混合液3天内使用完。
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
