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技术文章
真菌/酵母尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP glucose pyrophosphorylase）活性 光谱法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）
点击次数：2792 发布时间：2020/9/10 9:04:20
尿苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶（uridine 5＇-diphosphoglucose pyrophosphorylase；UDP glucose pyrophosphorylase；UGPase；EC2.7.7.9），又称三磷酸尿苷葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶（UTP glucose-1-phosphate uridylyltransferase），是碳水化合物代谢中的主要酶蛋白，广泛存在于动物、植物和微生物细胞的胞浆里。在真核生物中，其氨基酸序列达55%同源。尿苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶主要催化葡萄糖-1-磷酸（glucose-1-phosphate）和三磷酸尿苷（UTP）反应产生尿苷二磷酸葡萄糖（UDP glucose）和无机焦磷酸（pyrophosphate）的可逆反应。其功能在于通过核糖（nucleotide sugar）的UDP葡萄糖，作为糖苷基供体（glycosyl donor）和各种糖体分子体（presursor），参与糖原、蔗糖、纤维素、糖脂、糖蛋白、蛋白聚糖以及酵母和植物细胞壁的生物合成。基于底物尿苷二磷酸葡萄糖和无机焦磷酸，通过尿苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶（phosphoglucomutase；PGM）和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase；G-6-PDH）反应系统，测定氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADP）转化为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADPH）所产生的吸光峰值的变化（340nm 波长），来定量分析尿苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶的活性。尿苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶反应系统为：
UGPase
UDP-glucose + pyrophosphate → glucose-1-phosphate + UTP
phosphoglucomutase
α-D-Glucose-1-Phosphate → α-D-Glucose-6-Phosphate
glucose-6-phosphate dehydrogenase
Glucose-6-Phosphate + β-NADP → 6-Phosphogluconate + β-NADPH
产品内容
HEPENGBIO裂解液（Reagent A） 10毫升
HEPENGBIO强化液（Reagent B） 2毫升
HEPENGBIO缓冲液（Reagent C） 20毫升
HEPENGBIO底物液（Reagent D） 2毫升
HEPENGBIO反应液（Reagent E） 2毫升
HEPENGBIO阴性液（Reagent F） 1毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存HEPENGBIO裂解液（Reagent A）、HEPENGBIO底物液（Reagent D）和HEPENGBIO反应液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO底物液（Reagent D）避免光照；有效 证6月
用户自备
1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
（微型）台式离心机：用于样品操作
培养箱：用于反应孵育
比色皿或96孔板：用于光谱分析的容器
分光光度仪或酶标仪：用于光谱分析
实验步骤
实验开始，将－20℃冰箱里的试剂盒中的HEPENGBIO裂解液（Reagent A）置入冰槽里融化。然后进行下列操作。
一、样品准备
1．准备好10毫升待测的新鲜真菌/酵母细胞（OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 107细胞/毫升）
2．移入到预冷的15毫升锥形离心管
3．置于冰槽里5分钟
4．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为1000g
5．小心抽去上清液
6．加入250微升HEPENGBIO裂解液（Reagent A），充分混匀
7．转移到预冷的1.5毫升离心管
8．加入100微升HEPENGBIO强化液（Reagent B）
9．强力涡旋震荡15
10．置于冰槽里1分钟
11．重复实验步骤9至10五次
12．加入250微升HEPENGBIO裂解液（Reagent A），充分混匀
13．放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－HEPENGBIO30030.1）
16．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、测定准备
1．开启并设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长340nm，间隔5分钟，读数7次（共30分钟），并置零
2．从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；HEPENGBIO底物液（Reagent D）避免光照
3．HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度
三、背景对照测定
1．移取780微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入100微升HEPENGBIO底物液（Reagent D）
3．加入100微升HEPENGBIO反应液（Reagent E）
4．上下倾倒数次，混匀
5．在37℃温度下孵育3分钟
6．加入20微升HEPENGBIO阴性液（Reagent F）
7．上下倾倒数次，混匀（限定在3之内）
8．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（30分钟读数－0分钟读数）
四、样品测定
1．移取780微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入100微升HEPENGBIO底物液（Reagent D）
3．加入100微升HEPENGBIO反应液（Reagent E）
4．上下倾倒数次，混匀
5．在37℃温度下孵育3分钟
6．加入20微升待测样品（20微克蛋白）（注意：样品须清澈）
7．上下倾倒数次，混匀（限定在3之内）
8．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（30分钟读数－0分钟读数）
五、计算样品活性
[（样品读数－背景读数）X 1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.02（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 30（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔NADP/分钟
六、酶标仪测定
1．在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
2．分别移取195微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到96孔板中的所有孔里
3．分别加入25微升HEPENGBIO底物液（Reagent D）
4．分别加入25微升HEPENGBIO反应液（Reagent E）
5．轻轻摇动96孔板
6．在37℃温度下孵育3分钟
7．分别加入5微升HEPENGBIO阴性液（Reagent F）或待测样品（20微克蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
8．轻轻摇动96孔板
9．即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和30分钟读数
10．活性计算
[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.25（体系容量；毫升）]÷[0.005（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 0.6（光径距离；厘米）X 30（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔NADP/分钟
注意事项
1．本产品为20次（比色皿）和80次（96孔板）操作，包括背景对照
2．操作时，须戴手套
3．系统操作过程中，背景测定只需1次
4．建议使用比色皿测定
5．样品须澄清，至关重要
6．HEPENGBIO强化液（Reagent B）为固体状，移取方法为：使用1毫升枪头，将尖端部分剪去；或使用0.5毫升PCR管的盖子内圈盛满；或秤重0.1克
7．加样后3内光谱测定
8．测定值由低到变化；测定可持续30分钟
9．光谱测定后，比色皿须清洗 底
10．样本测定30分钟读数于0分钟读数表明具有酶活性
11．建议待测样本蛋白浓度为20微克/20微升；如果样本酶活性过低或过， 则可以增加或降低样本量（本公司提供 HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－HEPENGBIO30030.1）
12．如果待测样品浓度过或过低，可以调整样品浓度
13．尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶单位活性定义为：在37℃，pH 7.5条件下，每分钟内能够还原1微摩尔烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）所需的酶量作为一个活性单位
14．本公司提供系列生化酶学检测试剂产品
原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司
